伊丽莎白出生时被指定为王位继承人，她同父异母的姐姐玛丽（后来的玛丽一世）成为她的服侍者。伊丽莎白于1533年9月7日出世在伦敦的普莱斯提亚宫，她是英王亨利八世和他的第二个王后安妮·博林唯一幸存的孩子。由于她父母是按新教教规结婚的，天主教认为她是一个私生女。
1536年5月19日，伊丽莎白三岁时，她的母亲安妮·博林被判叛逆罪处死。伊丽莎白被宣布为私生女，从“伊丽莎白公主”变成了“伊丽莎白·都铎小姐”。
1537年，亨利八世和他的第三个王后简·西摩生了一个男孩：爱德华（后来的爱德华六世）。伊丽莎白和玛丽都成了爱德华的佣人。当爱德华接受洗礼时，伊丽莎白为爱德华献上白色洗礼服，将圣油涂抹在爱德华的身上。
1543年，伊丽莎白年迈的父亲亨利最终娶了在宫廷任职的凯瑟琳·帕尔为他的第六任妻子。凯瑟琳·帕尔王后对玛丽和伊丽莎白两个公主都很好，让她们受到很好的教育，有可靠的朋友和同龄的伴侣。受到王后影响，亨利八世和两个女儿玛丽、伊丽莎白和解。
伊丽莎白的教师包括英国文艺复兴时期著名的人文主义者罗杰·阿斯坎。她受到古典、历史、数学、诗歌和语言的教育。她可以说和写六种语言：英语、法语、意大利语、西班牙语、拉丁语和希腊语。
伊丽莎白在王后凯瑟琳·帕尔和其他教师的影响下成为了一个新教徒。
在凯瑟琳·帕尔王后的劝解下，1544年，亨利通过第三次继承法案，重新赋予玛丽和伊丽莎白王位继承权，位置在爱德华王子之后。但两人仍然是法律上的私生女。
1547年，亨利八世去世，爱德华六世继位。由于当时爱德华年纪尚幼，政权落在以新教徒为多的摄政议会中，这些新教徒尝试使新教成为英格兰的国教，因而伊丽莎白的王位继承人地位比较稳定。
但是1553年，爱德华得知自己的生命已到末期后，与议会拟定了“继承案”，试图阻止国家再度落入天主教势力。爱德华任命他的表亲珍·格蕾（简·格雷）为王位继承人，将他同父异母的姐姐玛丽和伊丽莎白都排除在外。