QELISA实验耗时多久？ A: 双抗体夹心ELISA法约需3.5-4小时，而竞争ELISA法则需2-2.5小时完成。 Q血清样本应如何处理？ A: 全血标本需室温静置2小时或4℃过夜，随后以1000×g离心20分钟，小心收集上清液。若保存期间出现沉淀，需再次离心处理。 Q血浆样本处理步骤是什么？ A: 推荐使用EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，以1000×g离心15分钟，仔细收集上清。若保存时产生沉淀，需重复离心步骤。 Q如何处理细胞上清液样本？ A: 检测分泌性成分时，使

第一步，确定调节YBX1表达的潜在机制---泛素-蛋白酶体降解途径 为了进一步确定调节YBX1表达的潜在机制，泛素-蛋白酶体降解途径和自噬-溶酶体途径是细胞内蛋白质降解的两种重要途径。用MG132、3MA和CQ处理原代神经元（3MA是一种广泛使用的抑制细胞自噬的抑制剂，可抑制III类PI3K；CQ通过增加酸性内体/溶酶体的pH值来破坏溶酶体功能；MG132是一种广泛使用的泛素-蛋白酶体降解途径抑制剂。），发现MG132处理后，YBX1的表达水平升高（图2a）。表明泛素-蛋

在国自然申请过程中，评审专家对申请书的质量有着严格的要求。申请书中的瑕疵和硬伤，尤其是那些让评审专家无法容忍的问题，可能会直接影响项目的评审结果。以下是一些常见的、评审专家无法容忍的瑕疵和硬伤，申请人在撰写申请书时应特别注意避免。 评审专家无法容忍的瑕疵1、大量错别字和语法错误：虽然个别的错别字或语法错误可以被容忍，但如果申请书中存在大量的这类问题，会给评审专家留下草率和不严谨的印象，影响对申请人专

在Western Blotting实验中，将目标蛋白高效地从凝胶转移至印迹膜上，是实验成功的关键一环。这一过程需要根据样品特性和目标蛋白的性质进行细致优化。以下是我们精心总结的六大策略，旨在帮助你提高WB转印效率。 1. 精选转印方式 首先，需根据实验需求选择最适合的转印方式。湿转，适用于广泛分子量范围的蛋白转印，膜与胶完全浸没在转印缓冲液中。半干转，则更适用于30-120kD范围内的蛋白，且转印速度更快，缓冲液仅覆盖膜与滤纸。而快速半

细胞铺板作为细胞培养中的一项常规技术，涉及将细胞悬浮液均匀地分布在培养皿或培养瓶的表层，以促进细胞的贴壁与生长。尽管此操作看似简易，实则蕴含诸多细节，稍有不慎便可能导致一系列问题，如铺板不均、细胞聚集等。 在细胞收集阶段，首要任务是确保细胞的均匀混合： 1. 胰酶处理环节 • 细胞需经过适度的消化处理，而消化条件需依据细胞类型及实验经验进行微调（针对新型细胞株，建议进行梯度测试以确定最佳条件）。 • 消化不足

实时荧光定量逆转录PCR（real-time quantitative reverse transcription PCR，简称RT-qPCR）是一种在PCR实验中，以RNA为起始材料的检测技术。此方法首先利用逆转录酶，将总RNA或信使RNA（mRNA）转录成互补DNA（cDNA）。 接着，以生成的cDNA作为模板，进行实时荧光定量PCR反应。RT-qPCR技术已广泛应用于分子生物学的多个领域，如基因表达水平分析、RNA干扰效果验证、微阵列数据验证、病原体筛查、基因诊断以及疾病相关研究。 RT-qPCR的两种实施方式：一步法与两步法 一步

免疫荧光（Immunofluorescence，IF）技术是一种强大的生物学工具，它利用荧光标记的抗体来精确定位和定性分析组织或细胞内的特定抗原。在细胞生物学研究中，细胞免疫荧光染色尤为常见，它能够帮助科学家们深入了解细胞内部的结构和功能。接下来，我们将详细介绍细胞爬片免疫荧光实验的操作步骤及一些小技巧。 实验器材及试剂 • 仪器和耗材：洁净工作台、CO2恒温培养箱、涡旋混合器、移液枪、正置荧光显微镜、成像系统。 • 试剂：4%多聚甲醛

免疫荧光（Immunofluorescence，IF）技术是一种强大的生物学工具，它利用荧光标记的抗体来精确定位和定性分析组织或细胞内的特定抗原。在细胞生物学研究中，细胞免疫荧光染色尤为常见，它能够帮助科学家们深入了解细胞内部的结构和功能。接下来，我们将详细介绍细胞爬片免疫荧光实验的操作步骤及一些小技巧。 实验器材及试剂 • 仪器和耗材：洁净工作台、CO2恒温培养箱、涡旋混合器、移液枪、正置荧光显微镜、成像系统。 • 试剂：4%多聚甲醛

泛素E3连接酶ABLIM1致癌作用的详细分子机制为了探索ABLIM1致癌作用的详细分子机制。敲减ABLIM1，进行RNA-seq，KEGG分析发现NF-κB信号显著富集，且通路相关的前10个基因表达被抑制（图1a-b）。细胞核和细胞质蛋白检测发现，ABLIM1敲除抑制了细胞质p65及其核转位（图1c）。GEPIA2数据库中结直肠癌和正常结直肠组织中RELA表达水平与ABLIM1表达水平呈正相关（图1d），支持ABLIM1对p65的调控。 ABLIM1调节IκBα/NF-κB/CCL20的活化（Ref. Fig4） 全文分享可查阅：【《Cell Death D

1. 封闭剂选择：选择与二抗种属来源相同的血清进行封闭，以减少非特异性结合。 2. 封闭时间：封闭时间不宜过长，30-60分钟即可。封闭后不用洗涤，直接加一抗孵育。 3. 一抗孵育：4°C过夜孵育一抗，可以使抗原抗体结合更加充分。 4. 一抗选择：考虑抗原名称、反应性和应用场景，选择最合适的一抗。 5. 二抗选择：根据一抗的种属来源、亚型和荧光标记来选择二抗。注意避免荧光素之间的串色。 6. 抗体稀释：一抗和二抗的稀释比例可以根据抗体说

Anti-Flag-HKDC1 IP-MS分析发现，候选互作分子中STAT1被预测为CD274转录因子（图1a）。然后，IP和GST下拉实验证实HKDC1可与STAT1结合（图1b-c）。同时，细胞实验表明STAT1是HKDC1介导PD-L1转录上调所必需的（图1d）。此外，WB检测发现HKDC1敲除显著减少STAT1的核转位（图1e）。磷酸化的STAT1残基Y701对其核转位和转录调节活性至关重要。WB分析发现HKDC1敲减STAT1-Y701磷酸化水平明显降低，该调控作用不受HKDC1己糖激酶活性的影响（图1f-h）。 结果表明，HKDC1通过促进STAT1磷酸

IP-MS分析，EZH2是多梳抑制复合体2 (PRC2)的功能性酶成分，与长期转录抑制相关。因此，确定EZH2为与Mi-2β蛋白复合物相关的染色质调节蛋白 (图2a)。内、外源性Co-IP表明EZH2和Mi-2β存在相互作用(图2b-c)，而EZH2敲减也显著上调Cxcl9和Cxcl10的水平(图2d)。 之前的研究表明， H3K27me3介导EZH2抑制ISGs的表达。体外证实EZH2沉默后，H3K27me3激活被显著抑制，且H3K27me3激活介导了由Mi-2β/EZH2复合物调控的ISG表达(图2e-g)。进一步ChIP分析证实，Mi-2β沉默后，Cxcl9和Cxcl10启动子区

为了确定Mi-2β如何影响黑色素瘤的免疫反应，进行微阵列分析。富集分析发现，Mi-2β敲除后，IFN-γ信号通路被激活（图1a），IFN-γ应答基因和抗原呈递基因上调（图1b）。IFN-γ在免疫治疗应答中起关键作用。Mi-2β沉默和抗PD-1治疗后Cxcl9和Cxcl10上调（图1c-e）。研究表明Mi-2β富集于基因组转录起始位点，在转录抑制中起重要作用。为了研究Mi-2β抑制IFN-γ信号的分子机制，进行ATAC-seq（染色质可及性），发现基因座内ATAC-seq峰的变化与IFN-γ信号相关（图1f）。

调控蛋白检测：circRNA是由其母基因ABR外显子3-16的外显子通过反向剪接生成的。与正常的PDAC组织和细胞相比，GEM耐药的PDAC组织和细胞中circRNA的表达上调。文献表调研明，QKI、FUS和ADAR1多种蛋白质参与circRNA合成过程中的反向剪接。作者研究这些蛋白与GEM耐药PDAC组织中circRNA表达之间的相关性，发现QKI与circRNA的表达呈正相关。进一步在GEM耐药的PDAC细胞中沉默了QKI，发现circRNA的表达下调，但目基因ABR的表达不受影响。 这些表明：QKI可能参与促进circRNA的形

三阴性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌中最恶性、预后最差的亚型。探索TNBC的新型致癌因素和治疗药物仍然是改善预后的重点。四氢姜黄素（THC）是姜黄素（CUR）的主要代谢产物，具有潜在的抗肿瘤活性。但THC在TNBC中的抗肿瘤活性和机制仍不清楚。 2024年11月4日，天津中医药大学康宁/邱峰/张强团队在Journal of Advanced Research（IF=11.4）上发表了题为“Tetrahydrocurcumin targets TRIP13 inhibiting the interaction of TRIP13/USP7/c-FLIP to mediate c-FLIP ubiquitination in triple-negative breast cancer

数据库分析筛选：通过FISH和核-细胞质RNA分离实验发现，circRNA主要分布在细胞核中。利用数据库（circAtlas2.0 database， ENCORI database; SPP database）分析发现，circRNA与LIG1启动子的结合蛋白有显著重叠，其中FOXA1是最显著的蛋白。进一步预测与FOXA1共同作用的蛋白，发现TET1与FOXA1结合。 调控互作复合体验证：在GEM耐药株中，CoIP验证FOXA1和TET1相互作用；进一步沉默FOXA1和TET1后，LIG1表达降低，证实在耐药株中FOXA1/TET1复合体协同调控LIG1表达。进一步通过ChIRP和RIP

组学发现：作者通过RNA-seq技术，检测沉默circRNA的PANC-1/GEM耐药株细胞与对照细胞，发现739个差异基因， 包括520个上调基因和219个下调基因。这些差异基因在多种DNA损伤修复通路中富集，包括碱基切除修复、错配修复和核苷酸切除修复。在这些通路中，包含显著下调的共同基因LIG1。LIG1是DNA连接酶家族的成员，在几乎所有DNA损伤修复通路中发挥着重要作用。 应答检测：在GEM抵抗的PDAC组织中，LIG1也高度表达，并且与PDAC组织中的circRNA表达呈正相关。沉默c

TRIM25是一种泛素连接酶，是否参与调控ITPKB蛋白稳定性积累呢？ 证据1：研究人员发现敲低Trim25，显著增加ITPKB蛋白积累；Trim25过表达则相反抑制其积累（图1a-b）。 证据2：加入蛋白酶体抑制剂MG132后，Trim25过表达诱导的ITPKB水平降低效应被逆转（图1c），表明Trim25通过蛋白酶体途径降低ITPKB的稳定性。 证据3：采用放线菌酮(CHX)追逐实验，发现Trim25敲低增加ITPKB蛋白的半衰期，Trim25过表达则相反（图1d-e）。 证据4：耐药细胞内源Co-IP分析显示Trim25敲低显著

第一步，TRPML1是通过泛素蛋白酶体途径降解的 蛋白酶体抑制剂MG132以浓度依赖的方式增强TRPML1的蛋白丰度，而BafaA1对TRPML1没有影响，表明TRPML1是通过泛素蛋白酶体途径降解的（图1a）。 第二步，β-TrCP可能是TRPML1泛素化的主要E3连接酶 Co-IP实验显示，β-TrCP过表达上调TRPML1泛素化水平，β-TrCP ΔF的失活体则不能（图1c）；此外，下调β-TrCP可降低TRPML1泛素化水平（图1d）。另外，Co-IP分析发现，K48R泛素突变体破坏了TRPML1的多泛素化，而K63R突变体则没有。此外

若你正致力于研究高分子量蛋白（超过150KD）， 却困扰于难以获得理想的Western blot结果， 那么本文一定是你想要的答案！ 01凝胶选择是关键 三大最常见的凝胶类型：Tris-Glycine、Bis-Tris与Tris-Acetate。 Tris-Glycine凝胶，pH值8.6，保质期短暂，运行中pH易升至9.5，引发蛋白降解与分辨率下降。 Bis-Tris凝胶，pH值6.4，相较于Tris-Glycine，稳定性与保质期有所提升，但需添加抗氧化剂（如DTT）保持蛋白还原状态。 Tris-Acetate凝胶，pH值7，针对大分子蛋白展现卓越分辨率

第一步，AARS1分别乳酸化YAP和TEADK90和K108位点 乳酸化蛋白质组学KEGG分析富集多种通路，重点集中在Hippo信号通路上，YAP和TEAD1分别在K90和K108位点发生了乳酸化（图1a-b）。IP-WB检测也显示YAP-TEAD发生乳酸化（图1c）。此外，构建YAP K90R和TEAD1 K108R突变体进行IP-WB检测显示没有发生乳酸化（图1d）。另外，葡萄糖剥夺降低YAP-TEAD1的乳酸化水平，而乳酸处理明显恢复其的乳酸化水平（图1e-f）。 第二步，AARS1与YAP-TEAD1相互作用 Co-IP实验发现AARS1与YAP-TEAD1互作（图1g

我们是成都专业生物医学实验室，在天府锦城实验室，有科研需求的老师联系。

第一步，探讨PRMT1在肝细胞癌中上调的机制 已有结果显示，PRMT1的蛋白水平在HCC中上调，但PRMT1 mRNA水平没有变化。推测泛素-蛋白酶体降解可能参与PRMT1的上调。用两种不同的蛋白酶体抑制剂处理细胞，发现PRMT1蛋白水平呈剂量依赖性增加（图1a），表明PRMT1的蛋白水平可以通过泛素介导的降解来调节。 第二步，确定PRMT1降解的关键泛素连接酶 根据设计的筛选策略，E3泛素连接酶FBXO7为候选互作蛋白（图1b-c）。IP-MS分析显示FBXO7是前10个与PRMT1相互作用的候

全自动步态分析系统在实验动物研究中具有重要的应用价值，尤其是在神经科学、药理学、遗传学以及生物医学工程等领域。使用全自动步态分析系统时，通常需要将动物放置在一个特制的通道内自由行走，系统会记录下它们的步伐长度、宽度、速度、足底压力分布等多个参数。通过对这些定量的步态数据的分析，研究人员可以获得关于实验动物运动协调性、平衡能力和肌肉力量等方面的信息，帮助研究人员评估实验处理（如疾病模型建立、药物干预

糖尿病肾病（DKD）是一种普遍存在的慢性肾脏疾病，是终末期肾病进展的主要原因。足细胞是覆盖GBM外表面的高度分化的上皮细胞，对于维持GBM的完整性至关重要。因此，足细胞损伤的程度通常用来评估DKD的进展。此外，足细胞中的炎症积聚与足细胞损伤的加重密切相关。 2024年6月，温州医科大学梁广团队在Nat Commun（IF=14.7）上，发表“Podocyte OTUD5 alleviates diabetic kidney disease through deubiquitinating TAK1 and reducing podocyte inflammation and injury”的研究成果。揭示