大家好，今天跟大家分享一篇题为PKM2-Driven Lactate Overpro duction Triggers Endo thelial-To-Mesen chymal Transition in lschemic Flap viaMe diating TWIsT1 Lactylation（PKM2驱动的乳酸过度生产通过介导TWIST1乳糖化触发缺血皮瓣内皮向间充质的转变）乳酸的积累是皮瓣移植术后患者的一个日益增长的风险因素。内皮-间充质转化(EndoMT)在皮肤纤维化中起着关键作用。
01
研究背景
乳酸的积累是皮瓣移植后患者不断上升的危险因素。内皮-间充质转化 （EndoMT） 在皮肤纤维化中起着关键作用。然而，乳酸过量是否直接导致皮瓣坏死及其机制仍不清楚。目前的研究表明，皮瓣小鼠表现出增强的 PKM2 和纤维化反应。PKM2 的内皮特异性缺失减轻了小鼠的皮瓣坏死并改善了皮瓣纤维化。
乳酸或过表达 PKM2 的给药可促进内皮细胞功能障碍，并刺激缺氧后间充质样表型。从机制上讲，糖酵解乳酸诱导 Twist1 和 p300/CBP 之间的相关性，导致 Twist1 赖氨酸 150 （K150la） 的乳酰化。K150la 的增加促进 Twist1 磷酸化和核转位，并进一步调节 TGFB1 的转录，从而诱导纤维化表型。小鼠内皮特异性 PKM2 的基因缺失减少了乳酸积累和 Twist1 乳酸化，然后减轻了皮瓣缺血后 EndoMT 相关的纤维化。
皮瓣移植患者血清乳酸水平升高，对预后具有预测价值。这一发现表明 PKM2 衍生的乳酸在介导 Twist1 乳酸化并加剧皮瓣纤维化和缺血中具有新作用。抑制糖酵解乳酸和 Twist1 乳酸化可减少皮瓣坏死和纤维化反应可能成为皮瓣缺血的潜在治疗策略。
见图一
PKM2 表达增强与缺血皮瓣中乳酸的产生和内皮-间充质转化有关。
图一
A） 代谢途径分析显示前 20 条途径参与了假皮肤和皮瓣小鼠皮肤之间的差异。
B） 热图显示假小鼠和皮瓣小鼠皮肤中参与丙酮酸代谢的差异表达基因。
C） 术后第 7 天假小鼠和皮瓣小鼠皮肤中的 PKM1 、 PKM2 和 HIF-1α 蛋白水平。
D） 术后第 7 天检测假小鼠和皮瓣小鼠皮肤中的二聚体和四聚体 PKM2 蛋白水平。
E） 术后第 7 天检测假小鼠和皮瓣小鼠皮肤中的 p-PKM2 （pY105） 表达。
F） 术后第 7 天假小鼠和皮瓣小鼠皮肤中 PKM1 、 PKM2 、 HIF-1α 和 p-PKM2 的相对蛋白表达。
G） 术后第 7 天假小鼠和皮瓣小鼠皮肤真皮层 HIF-1α 和 PKM2 的免疫荧光共染色。比例尺：10 μm。
H，I） 上述两组 （n = 5） 中 HIF-1α 和 PKM2 的荧光强度比较。
J） 通过厌氧糖酵解葡萄糖通量的主要代谢途径示意图。
K，L） 术后第 7 天测量假小鼠和皮瓣小鼠的血清和皮肤乳酸水平。（n = 5） 的M） 术后第 7 天假小鼠和皮瓣小鼠皮肤中 H&E 染色和 Masson 染色的代表性显微照片。比例尺：50 μm。
N，O） 上述两组中纤维化面积和血管数的定量。（n = 5） 的P） 术后第 7 天假手术和皮瓣小鼠皮肤中内皮标志物 CD31、VE-钙粘蛋白、间充质标志物 α-SMA、胶原蛋白 1a1 和 FSP1 的蛋白水平。
Q） 术后第 7 天假小鼠和皮瓣小鼠皮肤间充质标志物 FSP1 的免疫荧光染色。比例尺：10 μm。
R） 上述两组 （n = 5） 中 FSP1 荧光强度的比较。图中列出了准确的 P 值。数据以 mean±S.D.（F、H、I、K、L、N 和 R）未配对的双尾 t 检验表示。
见图二
PKM2 调节缺氧后内皮细胞中的乳酸产生和 EndoMT。在缺氧或常氧攻击后用 PKM2 siRNA 转染 HUVECs。
图二
A） 使用蛋白质印迹法测定 PKM2 在 HUVEC 中的敲低效率。
B） 常氧或缺氧下内皮标志物 CD31 和间充质标志物 α-SMA 的 Western blotting 检测。
C） 缺氧后敲低 PKM2 降低了 HUVEC 的葡萄糖摄取 （n = 3）。
D） 缺氧后 PKM2 敲低下调了 HUVEC 中的乳酸产生 （n = 3）。
E-G） 培养和转染的 HUVEC 的糖酵解应激、糖酵解速率和线粒体应激测定，如图中所示。
H） 术后第 7 天上述组 PKM2 和间充质标志物 FSP1 的 H&E 染色、Masson 染色和免疫荧光共染色。
I，J） 上述四组中纤维化面积和血管数的定量 （n = 5）。比例尺：上面板：50 μm，中面板：50 μm，下面板：10 μm。
K，L） 上述四组 （n = 5） FSP1 和 PKM2 的荧光强度比较。图中列出了准确的 P 值。数据表示为平均值±S.D. C-G）、双向方差分析;I-L），未配对的双尾 t 检验。
见图三
补充乳酸可加速缺氧后内皮细胞的 EndoMT 进展。在常氧或缺氧条件下用 10 mM 乳酸培养 HUVECs。
图三
A） HUVEC 形态的代表性图像。比例尺：50 μm、25 μm。
B） 内皮标志物 VE-钙粘蛋白和间充质标志物 FSP1 的免疫荧光共染色 （n = 3）。比例尺：25 μm。
C） 内皮细胞中间充质标志物 α-SMA 和内皮标志物 VE-钙粘蛋白的蛋白质印迹测量。
D） 内皮细胞中间充质标志物 α-SMA 和内皮标志物 VE-钙粘蛋白的 qRT-PCR 检测。（n = 3） 的 URL 中。
E） 通过管形成试验测定内皮细胞的血管生成 （n = 3）。比例尺：200 μm。
F） 使用 transwell 测定法检测内皮细胞的迁移 （n = 3）。比例尺：200 μm。
G） 通过胶原凝胶收缩试验 （n = 3） 测定内皮细胞收缩力。图中列出了准确的 P 值。数据以平均值±S.D. B 和 D-G）、双向方差分析表示。
见图四
乳酸在皮瓣缺血/缺氧后诱导 TGF-β/Smad2 通路。
图四
A-D） 在暴露于常氧或缺氧后，用 10 mM 乳酸刺激 HUVECs。qRT-PCR 检测 TGFB1 、 SMAD2 和 SMAD3 的 mRNA 水平 （n = 3）。进行 Western blotting 以测量 TGF-β 、 phospho （p）-SMAD2 、 phospho-SMAD3 的表达。
E-G） qRT-PCR 检测术后第 7 天 （n = 5） 假小鼠和皮瓣小鼠皮肤中 TGFB1 、 SMAD2 和 SMAD3 的 mRNA 表达。Western blotting 检测上述各组 （n = 5） 磷酸化 SMAD2 和 TGF-β 蛋白水平。
H） 上述组 （n = 5） PKM2 和 TGF-β 的免疫荧光共染色。比例尺，10 μm。
I） 上述组中 PKM2 和磷酸化 SMAD2 的免疫荧光共染色 （n = 5）。比例尺，10 μm。图中列出了准确的 P 值。数据以 mean±S.D. （A-C）、双向方差分析;（E 和 G-I），不成对的双尾 t 检验。
见图五
乳酸在缺氧后加速 Twist1 核转位和乳酰化。在常氧或缺氧条件下用 10 mM 乳酸培养 HUVECs。
图五
A，B） Western blotting 和免疫荧光染色检测内皮细胞中细胞质 Twist1 和细胞核 Twist1 的表达水平。比例尺，20 μm。
C，D） 采用 Western blotting 和免疫荧光染色检测术后第 7 天 假小鼠和皮瓣小鼠皮肤中细胞质 Twist1 和核 Twist1 的表达水平 （n = 5）。比例尺，10 μm。
E） 进行 Western blotting 以评估磷酸化 （p）-Twist1 （pS68） 和 Twist1 的表达。
F） 使用免疫沉淀 （IP） 检测 Twist1 的乳酰化和乙酰化，以及 Twist1 和 p300/CBP 之间的相互作用。在乳酸处理前，利用 G–K） MCT 抑制剂 CHC 抑制内皮细胞的细胞内乳酸。通过免疫沉淀检测 Twist1 的乳酰化和乙酰化，以及 Twist1 和 p300/CBP 之间的相互作用。图中列出了准确的 P 值。数据以 mean±S.D. 表示。A，B），未成对的双尾 t 检验;C，D），双向方差分析。
见图六
乳酸介导的 Twist1 核转位反过来激活 TGFB1 表达。在常氧或缺氧条件下用 10 mM 乳酸培养 HUVECs。
图六
A） 使用抗 Twist1 抗体进行 ChIP 实验，并使用对内皮细胞中 TGF-β 启动子具有特异性的引物进行 qRT-PCR （n = 3）。
B） 使用 JASPAR 数据库的 Twist1 转录因子结合位点。
C，D） 在内皮细胞中使用 ChIP 测定鉴定 Twist1 与 TGFB1 启动子的直接结合，包括非特异性对照 （ChIP NC） （位于转录起始位点上游 3000 bp 的序列）、TGFB1-ChIP1 和 TGFB1-ChIP2。
E） 在内皮细胞中使用 qRT-PCR 证实 Twist1 与 TGFB1 启动子的直接结合能力 （n = 3）。
F） 采用双荧光素酶报告基因测定以 ChIP 1 和 ChIP 2 元件依赖性方式评估 Twist1 对 TGFB1 转录的调节 （n = 3）。图中列出了准确的 P 值。数据以 mean±S.D. 表示。A） 双向方差分析;E，F），未成对的双尾 t 检验;。
02
研究结论
总之，我们的研究阐明了糖酵解衍生的乳酸在皮瓣缺血/缺氧后加速 EndoMT 中起的未确定作用。糖酵解衍生的乳酸刺激 Twist1 的核转位和乳酰化，进而通过激活 TGF-β/Smad2 通路促进 EndoMT 进展。这些发现为糖酵解衍生的乳酸提供了以前未实现的观点，这表明它在内皮细胞功能障碍中发挥作用，并显示出作为重要代谢生物标志物的潜力以及皮瓣缺血诱导的纤维化和坏死的促成因素。
好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理. 数据分析等支持.也随时可以联系我们。
01
研究背景
乳酸的积累是皮瓣移植后患者不断上升的危险因素。内皮-间充质转化 （EndoMT） 在皮肤纤维化中起着关键作用。然而，乳酸过量是否直接导致皮瓣坏死及其机制仍不清楚。目前的研究表明，皮瓣小鼠表现出增强的 PKM2 和纤维化反应。PKM2 的内皮特异性缺失减轻了小鼠的皮瓣坏死并改善了皮瓣纤维化。
乳酸或过表达 PKM2 的给药可促进内皮细胞功能障碍，并刺激缺氧后间充质样表型。从机制上讲，糖酵解乳酸诱导 Twist1 和 p300/CBP 之间的相关性，导致 Twist1 赖氨酸 150 （K150la） 的乳酰化。K150la 的增加促进 Twist1 磷酸化和核转位，并进一步调节 TGFB1 的转录，从而诱导纤维化表型。小鼠内皮特异性 PKM2 的基因缺失减少了乳酸积累和 Twist1 乳酸化，然后减轻了皮瓣缺血后 EndoMT 相关的纤维化。
皮瓣移植患者血清乳酸水平升高，对预后具有预测价值。这一发现表明 PKM2 衍生的乳酸在介导 Twist1 乳酸化并加剧皮瓣纤维化和缺血中具有新作用。抑制糖酵解乳酸和 Twist1 乳酸化可减少皮瓣坏死和纤维化反应可能成为皮瓣缺血的潜在治疗策略。
见图一
PKM2 表达增强与缺血皮瓣中乳酸的产生和内皮-间充质转化有关。
图一
A） 代谢途径分析显示前 20 条途径参与了假皮肤和皮瓣小鼠皮肤之间的差异。
B） 热图显示假小鼠和皮瓣小鼠皮肤中参与丙酮酸代谢的差异表达基因。
C） 术后第 7 天假小鼠和皮瓣小鼠皮肤中的 PKM1 、 PKM2 和 HIF-1α 蛋白水平。
D） 术后第 7 天检测假小鼠和皮瓣小鼠皮肤中的二聚体和四聚体 PKM2 蛋白水平。
E） 术后第 7 天检测假小鼠和皮瓣小鼠皮肤中的 p-PKM2 （pY105） 表达。
F） 术后第 7 天假小鼠和皮瓣小鼠皮肤中 PKM1 、 PKM2 、 HIF-1α 和 p-PKM2 的相对蛋白表达。
G） 术后第 7 天假小鼠和皮瓣小鼠皮肤真皮层 HIF-1α 和 PKM2 的免疫荧光共染色。比例尺：10 μm。
H，I） 上述两组 （n = 5） 中 HIF-1α 和 PKM2 的荧光强度比较。
J） 通过厌氧糖酵解葡萄糖通量的主要代谢途径示意图。
K，L） 术后第 7 天测量假小鼠和皮瓣小鼠的血清和皮肤乳酸水平。（n = 5） 的M） 术后第 7 天假小鼠和皮瓣小鼠皮肤中 H&E 染色和 Masson 染色的代表性显微照片。比例尺：50 μm。
N，O） 上述两组中纤维化面积和血管数的定量。（n = 5） 的P） 术后第 7 天假手术和皮瓣小鼠皮肤中内皮标志物 CD31、VE-钙粘蛋白、间充质标志物 α-SMA、胶原蛋白 1a1 和 FSP1 的蛋白水平。
Q） 术后第 7 天假小鼠和皮瓣小鼠皮肤间充质标志物 FSP1 的免疫荧光染色。比例尺：10 μm。
R） 上述两组 （n = 5） 中 FSP1 荧光强度的比较。图中列出了准确的 P 值。数据以 mean±S.D.（F、H、I、K、L、N 和 R）未配对的双尾 t 检验表示。
见图二
PKM2 调节缺氧后内皮细胞中的乳酸产生和 EndoMT。在缺氧或常氧攻击后用 PKM2 siRNA 转染 HUVECs。
图二
A） 使用蛋白质印迹法测定 PKM2 在 HUVEC 中的敲低效率。
B） 常氧或缺氧下内皮标志物 CD31 和间充质标志物 α-SMA 的 Western blotting 检测。
C） 缺氧后敲低 PKM2 降低了 HUVEC 的葡萄糖摄取 （n = 3）。
D） 缺氧后 PKM2 敲低下调了 HUVEC 中的乳酸产生 （n = 3）。
E-G） 培养和转染的 HUVEC 的糖酵解应激、糖酵解速率和线粒体应激测定，如图中所示。
H） 术后第 7 天上述组 PKM2 和间充质标志物 FSP1 的 H&E 染色、Masson 染色和免疫荧光共染色。
I，J） 上述四组中纤维化面积和血管数的定量 （n = 5）。比例尺：上面板：50 μm，中面板：50 μm，下面板：10 μm。
K，L） 上述四组 （n = 5） FSP1 和 PKM2 的荧光强度比较。图中列出了准确的 P 值。数据表示为平均值±S.D. C-G）、双向方差分析;I-L），未配对的双尾 t 检验。
见图三
补充乳酸可加速缺氧后内皮细胞的 EndoMT 进展。在常氧或缺氧条件下用 10 mM 乳酸培养 HUVECs。
图三
A） HUVEC 形态的代表性图像。比例尺：50 μm、25 μm。
B） 内皮标志物 VE-钙粘蛋白和间充质标志物 FSP1 的免疫荧光共染色 （n = 3）。比例尺：25 μm。
C） 内皮细胞中间充质标志物 α-SMA 和内皮标志物 VE-钙粘蛋白的蛋白质印迹测量。
D） 内皮细胞中间充质标志物 α-SMA 和内皮标志物 VE-钙粘蛋白的 qRT-PCR 检测。（n = 3） 的 URL 中。
E） 通过管形成试验测定内皮细胞的血管生成 （n = 3）。比例尺：200 μm。
F） 使用 transwell 测定法检测内皮细胞的迁移 （n = 3）。比例尺：200 μm。
G） 通过胶原凝胶收缩试验 （n = 3） 测定内皮细胞收缩力。图中列出了准确的 P 值。数据以平均值±S.D. B 和 D-G）、双向方差分析表示。
见图四
乳酸在皮瓣缺血/缺氧后诱导 TGF-β/Smad2 通路。
图四
A-D） 在暴露于常氧或缺氧后，用 10 mM 乳酸刺激 HUVECs。qRT-PCR 检测 TGFB1 、 SMAD2 和 SMAD3 的 mRNA 水平 （n = 3）。进行 Western blotting 以测量 TGF-β 、 phospho （p）-SMAD2 、 phospho-SMAD3 的表达。
E-G） qRT-PCR 检测术后第 7 天 （n = 5） 假小鼠和皮瓣小鼠皮肤中 TGFB1 、 SMAD2 和 SMAD3 的 mRNA 表达。Western blotting 检测上述各组 （n = 5） 磷酸化 SMAD2 和 TGF-β 蛋白水平。
H） 上述组 （n = 5） PKM2 和 TGF-β 的免疫荧光共染色。比例尺，10 μm。
I） 上述组中 PKM2 和磷酸化 SMAD2 的免疫荧光共染色 （n = 5）。比例尺，10 μm。图中列出了准确的 P 值。数据以 mean±S.D. （A-C）、双向方差分析;（E 和 G-I），不成对的双尾 t 检验。
见图五
乳酸在缺氧后加速 Twist1 核转位和乳酰化。在常氧或缺氧条件下用 10 mM 乳酸培养 HUVECs。
图五
A，B） Western blotting 和免疫荧光染色检测内皮细胞中细胞质 Twist1 和细胞核 Twist1 的表达水平。比例尺，20 μm。
C，D） 采用 Western blotting 和免疫荧光染色检测术后第 7 天 假小鼠和皮瓣小鼠皮肤中细胞质 Twist1 和核 Twist1 的表达水平 （n = 5）。比例尺，10 μm。
E） 进行 Western blotting 以评估磷酸化 （p）-Twist1 （pS68） 和 Twist1 的表达。
F） 使用免疫沉淀 （IP） 检测 Twist1 的乳酰化和乙酰化，以及 Twist1 和 p300/CBP 之间的相互作用。在乳酸处理前，利用 G–K） MCT 抑制剂 CHC 抑制内皮细胞的细胞内乳酸。通过免疫沉淀检测 Twist1 的乳酰化和乙酰化，以及 Twist1 和 p300/CBP 之间的相互作用。图中列出了准确的 P 值。数据以 mean±S.D. 表示。A，B），未成对的双尾 t 检验;C，D），双向方差分析。
见图六
乳酸介导的 Twist1 核转位反过来激活 TGFB1 表达。在常氧或缺氧条件下用 10 mM 乳酸培养 HUVECs。
图六
A） 使用抗 Twist1 抗体进行 ChIP 实验，并使用对内皮细胞中 TGF-β 启动子具有特异性的引物进行 qRT-PCR （n = 3）。
B） 使用 JASPAR 数据库的 Twist1 转录因子结合位点。
C，D） 在内皮细胞中使用 ChIP 测定鉴定 Twist1 与 TGFB1 启动子的直接结合，包括非特异性对照 （ChIP NC） （位于转录起始位点上游 3000 bp 的序列）、TGFB1-ChIP1 和 TGFB1-ChIP2。
E） 在内皮细胞中使用 qRT-PCR 证实 Twist1 与 TGFB1 启动子的直接结合能力 （n = 3）。
F） 采用双荧光素酶报告基因测定以 ChIP 1 和 ChIP 2 元件依赖性方式评估 Twist1 对 TGFB1 转录的调节 （n = 3）。图中列出了准确的 P 值。数据以 mean±S.D. 表示。A） 双向方差分析;E，F），未成对的双尾 t 检验;。
02
研究结论
总之，我们的研究阐明了糖酵解衍生的乳酸在皮瓣缺血/缺氧后加速 EndoMT 中起的未确定作用。糖酵解衍生的乳酸刺激 Twist1 的核转位和乳酰化，进而通过激活 TGF-β/Smad2 通路促进 EndoMT 进展。这些发现为糖酵解衍生的乳酸提供了以前未实现的观点，这表明它在内皮细胞功能障碍中发挥作用，并显示出作为重要代谢生物标志物的潜力以及皮瓣缺血诱导的纤维化和坏死的促成因素。
好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理. 数据分析等支持.也随时可以联系我们。
