《PNAS》分子互作机制
第一步，确定与下游蛋白分子的互作关系
内源Co-IP实验和GST pulldown实验发现USP8与GPX4互作（图2a-c）。
第二步，探索USP8与GPX4蛋白结合的具体位置
针对USP8构建不同的突变体分别进行Co-IP实验，发现USP8通过 aa1-313、aa715-1118区域与GPX4结合（图2d-e）。
第三步，USP8如何影响GPX4蛋白的稳定性
USP8是一个去泛素化酶。Co-IP分析发现，USP8能降低GPX4的泛素化水平，而酶非活性突变体USP8-c786a则不能去除GPX4的泛素链，表明USP8通过其去泛素化酶活性去除GPX4的泛素化（图2f）。
第四步，确定USP8去除GPX4的Ub K48链泛素化
泛素分子可以通过其七个赖氨酸(K)残基中的一个(K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63)连接形成不同的泛素链。基于此，Co-IP分析发现GPX4被K27和K48连接的泛素化修饰（图3a）。另外，Co-IP分析显示USP8过表达降低GPX4上K48连接的泛素化，而不影响K27连接的泛素化（图3b），表明USP8主要去除GPX4上K48连接的泛素化。
体外去泛素化试验表明（注：Ub(K48O)(只有完整的Lys48残基的Ub)），USP8过表达以去泛素酶活性依赖性方式去除GPX4上K48连接的泛素化（图3c）。
第五步，确定USP8去除GPX4蛋白泛素化位点
之前的研究已报道K48、K125、K127、K135和K151是GPX4的潜在泛素化位点。构建不同的泛素化位点突变体进行Co-IP分析，发现GPX4 K48R、K125R、K127R和K151R突变体K48连接的泛素化减少（图3d）。另外，USP8过表达降低GPX4 WT、K125R、K127R和K151R突变体的泛素化，但未能消除GPX4 K48R突变体的泛素化（图3e）。表明USP8主要去除GPX4上K48残基的泛素化。
综上所述，表明USP8作为稳定GPX4的关键上游调节因子，主要通过去除GPX4上K48连接的泛素化来防止其蛋白酶体介导的降解。
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