分子互作蛋白如何筛选？
🔬国刊之光《STTT》：分子互作蛋白筛选，从机制到验证全流程。
🌟 STEP1：锁定调控层级——先排除转录干扰！
✔️ 现象：复发性组织+TMZ耐药细胞中，ITPKB蛋白（非mRNA）显著升高（图1a-b）→暗示是转录后调控（比如降解减少/稳定性增加）。
💡 划重点：若mRNA与蛋白表达趋势不一致，优先考虑翻译后修饰（泛素化、磷酸化等）或蛋白互作调控！
🌟 STEP2：互作泛素酶筛选——CoIP-MS挖出关键“剪刀手”
🔎 技术流：用CoIP-MS钓取ITPKB的互作蛋白，锁定泛素连接酶Trim25（图1c）→ 泛素酶=调控蛋白“寿命”的开关！
💡 小白贴士：泛素连接酶负责给靶蛋白“贴死亡标签”，若互作减弱→靶蛋白积累（比如耐药细胞中ITPKB升高）
🌟 STEP3：互作验证——内外源实验双保险！
✅ 内源验证：anti-Trim25抗体做CoIP→耐药细胞中Trim25与ITPKB结合更弱（图1d）；TMZ处理敏感细胞后，互作也减弱（图1e）→ 环境压力破坏二者互作！
✅ 外源验证：过表达Trim25+ITPKB，TMZ处理依旧削弱互作（图1f）→ 排除内源表达量干扰，实锤互作真实性！ ⚠️ 避坑指南：内源验证更贴近生理状态，外源实验可强化信号，双管齐下让人无话可说！
🌟 STEP4：关键结构域互作验证 ——拆解蛋白找“接头”
🔧 策略：构建ITPKB截短突变体（比如激酶结构域缺失体），CoIP检测发现激酶结构域是结合Trim25的必备条件（图1g-h）→ 功能域锁定成功！ 💡 延申思考：若激酶域参与互作，可能影响ITPKB的酶活或稳定性→ 可进一步检测磷酸化水平或蛋白半衰期！
📌 总结高分逻辑链
1️⃣ 表型入手：先明确蛋白（非mRNA）差异→锁定转录后机制；
2️⃣ 互作挖掘：CoIP-MS筛泛素酶→优先验证功能关联强的分子；
3️⃣ 动态验证：比较不同处理组（耐药vs敏感，药物处理vs对照）→体现互作的环境依赖性；
4️⃣ 机制深挖：结构域定位→为功能研究提供锚点！
🔥 下期预告：如何验证Trim25对ITPKB蛋白稳定性的调控？
专注互作机制研究，如有Co-IP实验相关科研问题，欢迎留言探讨。
🔬国刊之光《STTT》：分子互作蛋白筛选，从机制到验证全流程。
🌟 STEP1：锁定调控层级——先排除转录干扰！
✔️ 现象：复发性组织+TMZ耐药细胞中，ITPKB蛋白（非mRNA）显著升高（图1a-b）→暗示是转录后调控（比如降解减少/稳定性增加）。
💡 划重点：若mRNA与蛋白表达趋势不一致，优先考虑翻译后修饰（泛素化、磷酸化等）或蛋白互作调控！
🌟 STEP2：互作泛素酶筛选——CoIP-MS挖出关键“剪刀手”
🔎 技术流：用CoIP-MS钓取ITPKB的互作蛋白，锁定泛素连接酶Trim25（图1c）→ 泛素酶=调控蛋白“寿命”的开关！
💡 小白贴士：泛素连接酶负责给靶蛋白“贴死亡标签”，若互作减弱→靶蛋白积累（比如耐药细胞中ITPKB升高）
🌟 STEP3：互作验证——内外源实验双保险！
✅ 内源验证：anti-Trim25抗体做CoIP→耐药细胞中Trim25与ITPKB结合更弱（图1d）；TMZ处理敏感细胞后，互作也减弱（图1e）→ 环境压力破坏二者互作！
✅ 外源验证：过表达Trim25+ITPKB，TMZ处理依旧削弱互作（图1f）→ 排除内源表达量干扰，实锤互作真实性！ ⚠️ 避坑指南：内源验证更贴近生理状态，外源实验可强化信号，双管齐下让人无话可说！
🌟 STEP4：关键结构域互作验证 ——拆解蛋白找“接头”
🔧 策略：构建ITPKB截短突变体（比如激酶结构域缺失体），CoIP检测发现激酶结构域是结合Trim25的必备条件（图1g-h）→ 功能域锁定成功！ 💡 延申思考：若激酶域参与互作，可能影响ITPKB的酶活或稳定性→ 可进一步检测磷酸化水平或蛋白半衰期！
📌 总结高分逻辑链
1️⃣ 表型入手：先明确蛋白（非mRNA）差异→锁定转录后机制；
2️⃣ 互作挖掘：CoIP-MS筛泛素酶→优先验证功能关联强的分子；
3️⃣ 动态验证：比较不同处理组（耐药vs敏感，药物处理vs对照）→体现互作的环境依赖性；
4️⃣ 机制深挖：结构域定位→为功能研究提供锚点！
🔥 下期预告：如何验证Trim25对ITPKB蛋白稳定性的调控？
专注互作机制研究，如有Co-IP实验相关科研问题，欢迎留言探讨。
