一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒
一步法 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒，是基于 TUNEL（Terminal - deoxynucleotidyl Transferase Mediated Nick End Labeling）技术，用于快速、灵敏检测细胞凋亡的实验工具。以下从原理、试剂盒组成、操作步骤、结果分析以及应用场景等方面展开介绍：
1. 检测原理
细胞凋亡时，内源性核酸内切酶被激活，将染色体 DNA 在核小体间切断，产生 180 - 200bp 整数倍的寡核苷酸片段，断裂 DNA 的 3'-OH 末端暴露。试剂盒利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT），将生物素或地高辛等标记的 dUTP 连接到 3'-OH 末端。之后，通过与标记物特异性结合的显色系统或荧光系统来显示凋亡细胞。以常用的地高辛标记为例，后续加入与地高辛特异性结合且偶联了辣根过氧化物酶（HRP）的抗体，HRP 催化底物显色，从而使凋亡细胞呈现可见颜色，便于在显微镜下观察。
2. 试剂盒组成
· TUNEL 反应混合液：包含末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）、标记的 dUTP（如地高辛 - dUTP）以及反应缓冲液，是试剂盒的核心成分，用于将标记物连接到凋亡细胞 DNA 的断裂末端。
· 转化剂 - POD：若采用地高辛标记，此试剂含有与地高辛特异性结合的抗体，并偶联了辣根过氧化物酶（POD），用于与 TUNEL 反应后标记有地高辛的 DNA 结合，以便后续进行显色反应。
· DAB 底物显色液：若使用 POD 作为标记物的检测系统，DAB（二氨基联苯胺）底物显色液在 POD 的作用下会发生显色反应，使凋亡细胞呈现棕褐色。
· 阳性对照试剂：通常为已知能诱导细胞凋亡的试剂，如放线菌素 D 等，用于验证试剂盒的有效性和实验流程的正确性。
· 阴性对照试剂：一般为未进行任何处理的正常细胞样本，用于设定检测的背景和对照，排除非特异性染色。
· 封片剂：用于封片，保护样品以便于长期观察和保存。
3. 操作步骤
1. 细胞或组织准备：
· 细胞样本：将细胞接种于培养板或载玻片上，待细胞贴壁后进行相应处理（如诱导凋亡处理）。
· 组织样本：需进行固定（如用 4% 多聚甲醛固定）、脱水、包埋、切片等常规组织学处理，将切片粘附在载玻片上。
2. 预处理：将细胞或组织切片用 PBS 洗涤后，用蛋白酶 K 溶液进行通透处理，使 TdT 酶等能够进入细胞内与 DNA 断裂末端结合。通透时间需根据样本类型进行优化，一般为 15 - 30 分钟。
3. TUNEL 染色：滴加 TUNEL 反应混合液于细胞或组织切片上，在湿盒中 37℃孵育 60 - 120 分钟，使 TdT 酶将标记的 dUTP 连接到 DNA 断裂末端。
4. 显色：
· 若使用地高辛标记系统，滴加转化剂 - POD 孵育 30 - 60 分钟后，用 PBS 洗涤，再滴加 DAB 底物显色液，在显微镜下观察细胞颜色变化，当凋亡细胞出现棕褐色时，用蒸馏水冲洗终止显色。
5. 复染与封片：为了更好地观察细胞形态，可选择用苏木精进行复染，使细胞核呈蓝色。复染后，用梯度酒精脱水，二甲苯透明，最后用封片剂封片。
4. 结果分析
· 显微镜观察：在光学显微镜下，凋亡细胞呈现棕褐色，正常细胞为浅蓝色（苏木精复染后）或无色（未复染）。通过观察细胞颜色和形态来判断细胞是否发生凋亡，并可进行凋亡细胞的计数。计算凋亡细胞占总细胞数的比例，以此评估细胞凋亡的程度。
· 图像分析软件：可借助图像分析软件对采集的图像进行定量分析，如测量阳性染色区域的面积、光密度等参数，更准确地评估细胞凋亡情况。
5. 应用场景
· 肿瘤研究：用于研究肿瘤细胞凋亡与肿瘤发生、发展、转移以及肿瘤治疗的关系，评估肿瘤治疗药物诱导肿瘤细胞凋亡的效果，为肿瘤治疗方案的制定和药物研发提供依据。
· 神经科学：在神经退行性疾病研究中，检测神经细胞的凋亡情况，探究疾病的发病机制和治疗靶点，如阿尔茨海默病、帕金森病等疾病中神经细胞凋亡的研究。
· 心血管疾病研究：研究心肌细胞、血管内皮细胞等在心肌梗死、动脉粥样硬化等心血管疾病中的凋亡变化，为疾病的诊断和治疗提供参考。
· 药物研发：在药物研发过程中，筛选和评价具有诱导细胞凋亡或抗细胞凋亡作用的药物，通过检测药物处理后细胞的凋亡情况，评估药物的疗效和安全性。
技术支持
亚科因（武汉）生物技术有限公司
Abbkine亚科因致力于细胞科研检测及细胞治疗领域关键生化检测试剂盒的研发、生产和销售,成为全球细胞制药领域创新的关键推动者。
一步法 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒，是基于 TUNEL（Terminal - deoxynucleotidyl Transferase Mediated Nick End Labeling）技术，用于快速、灵敏检测细胞凋亡的实验工具。以下从原理、试剂盒组成、操作步骤、结果分析以及应用场景等方面展开介绍：
1. 检测原理
细胞凋亡时，内源性核酸内切酶被激活，将染色体 DNA 在核小体间切断，产生 180 - 200bp 整数倍的寡核苷酸片段，断裂 DNA 的 3'-OH 末端暴露。试剂盒利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT），将生物素或地高辛等标记的 dUTP 连接到 3'-OH 末端。之后，通过与标记物特异性结合的显色系统或荧光系统来显示凋亡细胞。以常用的地高辛标记为例，后续加入与地高辛特异性结合且偶联了辣根过氧化物酶（HRP）的抗体，HRP 催化底物显色，从而使凋亡细胞呈现可见颜色，便于在显微镜下观察。
2. 试剂盒组成
· TUNEL 反应混合液：包含末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）、标记的 dUTP（如地高辛 - dUTP）以及反应缓冲液，是试剂盒的核心成分，用于将标记物连接到凋亡细胞 DNA 的断裂末端。
· 转化剂 - POD：若采用地高辛标记，此试剂含有与地高辛特异性结合的抗体，并偶联了辣根过氧化物酶（POD），用于与 TUNEL 反应后标记有地高辛的 DNA 结合，以便后续进行显色反应。
· DAB 底物显色液：若使用 POD 作为标记物的检测系统，DAB（二氨基联苯胺）底物显色液在 POD 的作用下会发生显色反应，使凋亡细胞呈现棕褐色。
· 阳性对照试剂：通常为已知能诱导细胞凋亡的试剂，如放线菌素 D 等，用于验证试剂盒的有效性和实验流程的正确性。
· 阴性对照试剂：一般为未进行任何处理的正常细胞样本，用于设定检测的背景和对照，排除非特异性染色。
· 封片剂：用于封片，保护样品以便于长期观察和保存。
3. 操作步骤
1. 细胞或组织准备：
· 细胞样本：将细胞接种于培养板或载玻片上，待细胞贴壁后进行相应处理（如诱导凋亡处理）。
· 组织样本：需进行固定（如用 4% 多聚甲醛固定）、脱水、包埋、切片等常规组织学处理，将切片粘附在载玻片上。
2. 预处理：将细胞或组织切片用 PBS 洗涤后，用蛋白酶 K 溶液进行通透处理，使 TdT 酶等能够进入细胞内与 DNA 断裂末端结合。通透时间需根据样本类型进行优化，一般为 15 - 30 分钟。
3. TUNEL 染色：滴加 TUNEL 反应混合液于细胞或组织切片上，在湿盒中 37℃孵育 60 - 120 分钟，使 TdT 酶将标记的 dUTP 连接到 DNA 断裂末端。
4. 显色：
· 若使用地高辛标记系统，滴加转化剂 - POD 孵育 30 - 60 分钟后，用 PBS 洗涤，再滴加 DAB 底物显色液，在显微镜下观察细胞颜色变化，当凋亡细胞出现棕褐色时，用蒸馏水冲洗终止显色。
5. 复染与封片：为了更好地观察细胞形态，可选择用苏木精进行复染，使细胞核呈蓝色。复染后，用梯度酒精脱水，二甲苯透明，最后用封片剂封片。
4. 结果分析
· 显微镜观察：在光学显微镜下，凋亡细胞呈现棕褐色，正常细胞为浅蓝色（苏木精复染后）或无色（未复染）。通过观察细胞颜色和形态来判断细胞是否发生凋亡，并可进行凋亡细胞的计数。计算凋亡细胞占总细胞数的比例，以此评估细胞凋亡的程度。
· 图像分析软件：可借助图像分析软件对采集的图像进行定量分析，如测量阳性染色区域的面积、光密度等参数，更准确地评估细胞凋亡情况。
5. 应用场景
· 肿瘤研究：用于研究肿瘤细胞凋亡与肿瘤发生、发展、转移以及肿瘤治疗的关系，评估肿瘤治疗药物诱导肿瘤细胞凋亡的效果，为肿瘤治疗方案的制定和药物研发提供依据。
· 神经科学：在神经退行性疾病研究中，检测神经细胞的凋亡情况，探究疾病的发病机制和治疗靶点，如阿尔茨海默病、帕金森病等疾病中神经细胞凋亡的研究。
· 心血管疾病研究：研究心肌细胞、血管内皮细胞等在心肌梗死、动脉粥样硬化等心血管疾病中的凋亡变化，为疾病的诊断和治疗提供参考。
· 药物研发：在药物研发过程中，筛选和评价具有诱导细胞凋亡或抗细胞凋亡作用的药物，通过检测药物处理后细胞的凋亡情况，评估药物的疗效和安全性。
技术支持
亚科因（武汉）生物技术有限公司
Abbkine亚科因致力于细胞科研检测及细胞治疗领域关键生化检测试剂盒的研发、生产和销售,成为全球细胞制药领域创新的关键推动者。
