自主荧光，指的是在组织或细胞样本进行荧光检测时，所产生的与目标信号无关的背景荧光信号。
解决自主荧光问题主要有两种途径：一是选用冰冻切片进行染色，二是减弱石蜡切片染色中的自主荧光。
本文将重点探讨：如何降低免疫荧光染色实验中石蜡切片的自主荧光。
一、石蜡切片的特性
01 石蜡切片厚度可达3微米，实验过程中组织损耗较小
在利用普通小鼠、基因敲除小鼠等小型动物进行实验时，我们经常需对同一组织进行病理学及分子生物学的研究。此时，冰冻切片会大幅消耗组织样本，而石蜡切片或许是一个更为妥善的选择。
02 石蜡切片能较好地维持抗原的空间构型
免疫学实验的初衷并非为了定量分析，而是为了观测抗原在组织中的空间位置。石蜡切片能几乎原位地保存组织结构的空间位置。
尽管冰冻切片几乎观察不到明显的自主荧光，但它也存在一个问题：若制片效果不佳，冰晶的形成或融化会导致抗原位置发生较大偏移。对于需要精确定位的研究对象或荧光多标记融合而言，这一点必须予以高度重视。
03 石蜡切片的弊端在于自主荧光过强
自主荧光指的是组织在未经荧光色素染色时，在激发光下自发产生的荧光。
根据实践经验，石蜡切片的自主荧光是影响实验结果的关键因素（原因尚不明朗），其分布均匀且弥漫，覆盖整张切片。在汞灯功率较大时，这一现象更为显著。紫外和紫光区域激发的如色氨酸类、吲哚胺类、纤维蛋白原、二聚体、胶原等，蓝光区域激发的主要是NADH、脂褐素、吲哚胺类、二聚体、核黄素等，均会产生自主荧光。
鉴于如此多的物质都会引发自主荧光，采用化学方法逐一消除显然不切实际，且可能去除“真实”的抗原荧光。因此，从整体上进行把控可能更为可取。
二、自主荧光消除策略
01 样本固定
样本通常采用中性的多聚甲醛进行固定，而醛类固定剂会与胺和蛋白反应生成荧光产物，这是引发自主荧光的重要因素之一。戊二醛的影响更为显著。样本的固定时间并非越长越好，常规固定1-2天即可。切忌使用长期浸泡在固定液中的组织进行免疫荧光标记实验。
建议：为尽量缩短固定时间，应将组织切割成适当的薄块（厚度不超过5毫米）后再进行固定，而非将整个大组织块直接投入。
02 染色过程中的调控
1）彻底清除切片上的石蜡残留
所有石蜡切片在染色前均需通过二甲苯去除石蜡。可将这一步的时间延长至平时的两倍，即二甲苯①、二甲苯②、二甲苯③各自至少停留30分钟。脱蜡后需烤片1小时左右，以提高脱蜡效率，并使组织与玻片贴合更紧密。
2）血清封闭
通常，大家会使用动物血清在室温下封闭1小时左右。可适当延长封闭时间至2小时。若室温较低，可考虑使用37摄氏度孵育箱进行封闭，以优化封闭时间并充分去除组织中的类属抗原。
封闭时所用的血清应尽量选择高质量的国外产品。若血清质量不佳，其中可能含有纤维蛋白原（正常血清不含纤维蛋白原），一旦附着于组织上便难以清洗，从而增强自主荧光信号。此外，低质量血清还含有诸多其他杂质。
3）一抗
一抗的浓度需通过预实验进行摸索，最好采用“棋盘法”进行浓度梯度的预测试。一抗浓度过高（荧光实验本身一抗浓度就较高）也是导致自主荧光强烈的重要原因。
4）荧光二抗
选用进口的荧光二抗至关重要。因为低质量的荧光二抗中往往残留较多未标记的游离荧光素，这些游离的荧光素未与蛋白质结合，会形成聚合物和衍生物，它们的自主荧光同样强烈。有人曾提议采用层析或透析的方式去除，但实际操作效果往往不尽如人意。最佳方案是选用进口的优质荧光二抗。
二抗孵育的时间也极为关键。许多人简单地将传统免疫组化（IHC）的时间照搬过来，即37摄氏度或室温孵育30分钟，这可能并不合适。最恰当的方法是通过充分的预实验来摸索二抗孵育的时间和温度。二抗孵育时间过长，切片的自主荧光会非常强烈且难以清洗；二抗孵育时间过短，则目标抗原无法充分结合，导致标记失败。
5） 阴性对照
必须确定切片脱蜡后，在不添加二抗的情况下是否仍能产生荧光。这是判断是否存在自主荧光的金标准。
03 切片的清洗
很多时候，清洗不彻底也会导致强烈的自主荧光。这一点在二抗孵育结束后的清洗过程中尤为重要。
因此，至少应在二抗之后进行多次清洗，5分钟×5次是一个可参考的标准。
解决自主荧光问题主要有两种途径：一是选用冰冻切片进行染色，二是减弱石蜡切片染色中的自主荧光。
本文将重点探讨：如何降低免疫荧光染色实验中石蜡切片的自主荧光。
一、石蜡切片的特性
01 石蜡切片厚度可达3微米，实验过程中组织损耗较小
在利用普通小鼠、基因敲除小鼠等小型动物进行实验时，我们经常需对同一组织进行病理学及分子生物学的研究。此时，冰冻切片会大幅消耗组织样本，而石蜡切片或许是一个更为妥善的选择。
02 石蜡切片能较好地维持抗原的空间构型
免疫学实验的初衷并非为了定量分析，而是为了观测抗原在组织中的空间位置。石蜡切片能几乎原位地保存组织结构的空间位置。
尽管冰冻切片几乎观察不到明显的自主荧光，但它也存在一个问题：若制片效果不佳，冰晶的形成或融化会导致抗原位置发生较大偏移。对于需要精确定位的研究对象或荧光多标记融合而言，这一点必须予以高度重视。
03 石蜡切片的弊端在于自主荧光过强
自主荧光指的是组织在未经荧光色素染色时，在激发光下自发产生的荧光。
根据实践经验，石蜡切片的自主荧光是影响实验结果的关键因素（原因尚不明朗），其分布均匀且弥漫，覆盖整张切片。在汞灯功率较大时，这一现象更为显著。紫外和紫光区域激发的如色氨酸类、吲哚胺类、纤维蛋白原、二聚体、胶原等，蓝光区域激发的主要是NADH、脂褐素、吲哚胺类、二聚体、核黄素等，均会产生自主荧光。
鉴于如此多的物质都会引发自主荧光，采用化学方法逐一消除显然不切实际，且可能去除“真实”的抗原荧光。因此，从整体上进行把控可能更为可取。
二、自主荧光消除策略
01 样本固定
样本通常采用中性的多聚甲醛进行固定，而醛类固定剂会与胺和蛋白反应生成荧光产物，这是引发自主荧光的重要因素之一。戊二醛的影响更为显著。样本的固定时间并非越长越好，常规固定1-2天即可。切忌使用长期浸泡在固定液中的组织进行免疫荧光标记实验。
建议：为尽量缩短固定时间，应将组织切割成适当的薄块（厚度不超过5毫米）后再进行固定，而非将整个大组织块直接投入。
02 染色过程中的调控
1）彻底清除切片上的石蜡残留
所有石蜡切片在染色前均需通过二甲苯去除石蜡。可将这一步的时间延长至平时的两倍，即二甲苯①、二甲苯②、二甲苯③各自至少停留30分钟。脱蜡后需烤片1小时左右，以提高脱蜡效率，并使组织与玻片贴合更紧密。
2）血清封闭
通常，大家会使用动物血清在室温下封闭1小时左右。可适当延长封闭时间至2小时。若室温较低，可考虑使用37摄氏度孵育箱进行封闭，以优化封闭时间并充分去除组织中的类属抗原。
封闭时所用的血清应尽量选择高质量的国外产品。若血清质量不佳，其中可能含有纤维蛋白原（正常血清不含纤维蛋白原），一旦附着于组织上便难以清洗，从而增强自主荧光信号。此外，低质量血清还含有诸多其他杂质。
3）一抗
一抗的浓度需通过预实验进行摸索，最好采用“棋盘法”进行浓度梯度的预测试。一抗浓度过高（荧光实验本身一抗浓度就较高）也是导致自主荧光强烈的重要原因。
4）荧光二抗
选用进口的荧光二抗至关重要。因为低质量的荧光二抗中往往残留较多未标记的游离荧光素，这些游离的荧光素未与蛋白质结合，会形成聚合物和衍生物，它们的自主荧光同样强烈。有人曾提议采用层析或透析的方式去除，但实际操作效果往往不尽如人意。最佳方案是选用进口的优质荧光二抗。
二抗孵育的时间也极为关键。许多人简单地将传统免疫组化（IHC）的时间照搬过来，即37摄氏度或室温孵育30分钟，这可能并不合适。最恰当的方法是通过充分的预实验来摸索二抗孵育的时间和温度。二抗孵育时间过长，切片的自主荧光会非常强烈且难以清洗；二抗孵育时间过短，则目标抗原无法充分结合，导致标记失败。
5） 阴性对照
必须确定切片脱蜡后，在不添加二抗的情况下是否仍能产生荧光。这是判断是否存在自主荧光的金标准。
03 切片的清洗
很多时候，清洗不彻底也会导致强烈的自主荧光。这一点在二抗孵育结束后的清洗过程中尤为重要。
因此，至少应在二抗之后进行多次清洗，5分钟×5次是一个可参考的标准。
