通常的RT-qPCR过程包含RNA提取、反转录和实时荧光PCR三个环节。当某些研究项目需要对某一生物进行多种处理，以检测特定基因的表达量，从而评估该基因对不同压力条件的抵抗能力；或者在某种病原体感染后，检测宿主多个基因的表达情况，以探索可能的通路和相互作用机制时……对于这类样本量大，但每个样本只需单次检测的实验，我们经常推荐采用一步式RT-qPCR方法，即将反转录和实时荧光PCR合并在一个反应体系中，一次操作即可完成表达量的测定。
由于将RNA反转录与实时荧光PCR的步骤合并为一步，因此实验操作的精确性和污染控制变得至关重要。针对一步式RT-qPCR的特殊性，以下总结了一些优化技巧，可以有效提升实验结果的稳定性和准确性。
1. 目标序列选择
选择80-200 bp的扩增片段，以确保PCR扩增效率达到最高。
片段的GC含量建议保持在40%至60%之间。
避免扩增片段与模板其他区域存在长片段的重复序列。
避免扩增片段形成二级结构。
2. RNA模板制备
优先选择高产、高纯度的RNA提取试剂。
RNA可保存在含有EDTA的溶液（1×TE）中，EDTA能螯合金属离子，消除对RNase的激活作用，从而保持RNA的完整性。
RNA提取后，可使用DNase I（ATG #E103）处理，以去除残留的基因组DNA。
3. 引物设计
常规引物长度为15-30个核苷酸，理想的引物GC含量为40-60%，熔解温度（Tm）尽量接近60℃，且上下游引物的Tm值差异尽量控制在3℃以内。避免出现4个连续的重复碱基，特别是4个G碱基。
引物浓度应按照说明书推荐值添加。引物过量可能导致引物二聚体或非特异性扩增，熔解曲线上出现杂峰。
当以cDNA为模板时，建议引物跨越内含子区域，以减少以基因组DNA为模板的扩增假阳性。
4. 探针设计
常规探针长度为15-30个核苷酸，以确保荧光基团能够有效猝灭，GC含量保持在40-60%。
通常情况下，非荧光猝灭基团相比荧光猝灭基团具有更高的信噪比。
避免探针的5’端为G碱基，以免猝灭荧光基团。
设计的探针应结合在正义链或反义链上。
探针的Tm值通常应比引物的Tm值高5-10℃，以确保在引物结合前，探针的全部序列能与模板充分结合。
5. 多重扩增
避免探针、引物之间以及目标序列之间存在重叠序列。
设计探针时，确保每个目标序列有唯一的检测荧光基团。
根据实时荧光PCR仪的检测范围选择荧光基团，荧光报告基团的发射光谱不应重叠。
在单重反应中检测每组引物/探针组合，以设定一个基线标准，确保在多重PCR时Ct值相近。
高丰度的目标序列可搭配低强度荧光染料，低丰度的目标序列则搭配高强度荧光染料
6. 反转录
反转录步骤的反应温度一般建议按照试剂说明书设置。对于具有复杂二级结构或高GC含量的模板，建议提高反应温度，以提高扩增效率和灵敏度。
7. 循环条件
通常情况下，按照说明书中的循环条件即可获得最佳效果。
可以进行较长片段的扩增（>400 bp），但可能需要优化延伸时间。
对于大多数情况，40个循环是足够的；对于极低起始量的样本，可以进行45个循环。
8. 反应体系建立
为了获得最佳结果，在热循环前请将反应体系置于冰上。
对于96孔板，建议使用20 μl反应体系；对于384孔板，建议使用10 μl反应体系。
每个样本应设置三个重复，并确保每个扩增子包含阴性对照（NTC）。
为避免交叉污染，在热循环前加入热敏UDG（ATG #E205），在37℃下处理10分钟。
9. 检测与评估
确保至少三个10倍梯度稀释模板的扩增效率在90-110%之间，相关系数（R²）应大于0.99。
通过产物长度、测序或熔解曲线分析来确认其特异性。
由于将RNA反转录与实时荧光PCR的步骤合并为一步，因此实验操作的精确性和污染控制变得至关重要。针对一步式RT-qPCR的特殊性，以下总结了一些优化技巧，可以有效提升实验结果的稳定性和准确性。
1. 目标序列选择
选择80-200 bp的扩增片段，以确保PCR扩增效率达到最高。
片段的GC含量建议保持在40%至60%之间。
避免扩增片段与模板其他区域存在长片段的重复序列。
避免扩增片段形成二级结构。
2. RNA模板制备
优先选择高产、高纯度的RNA提取试剂。
RNA可保存在含有EDTA的溶液（1×TE）中，EDTA能螯合金属离子，消除对RNase的激活作用，从而保持RNA的完整性。
RNA提取后，可使用DNase I（ATG #E103）处理，以去除残留的基因组DNA。
3. 引物设计
常规引物长度为15-30个核苷酸，理想的引物GC含量为40-60%，熔解温度（Tm）尽量接近60℃，且上下游引物的Tm值差异尽量控制在3℃以内。避免出现4个连续的重复碱基，特别是4个G碱基。
引物浓度应按照说明书推荐值添加。引物过量可能导致引物二聚体或非特异性扩增，熔解曲线上出现杂峰。
当以cDNA为模板时，建议引物跨越内含子区域，以减少以基因组DNA为模板的扩增假阳性。
4. 探针设计
常规探针长度为15-30个核苷酸，以确保荧光基团能够有效猝灭，GC含量保持在40-60%。
通常情况下，非荧光猝灭基团相比荧光猝灭基团具有更高的信噪比。
避免探针的5’端为G碱基，以免猝灭荧光基团。
设计的探针应结合在正义链或反义链上。
探针的Tm值通常应比引物的Tm值高5-10℃，以确保在引物结合前，探针的全部序列能与模板充分结合。
5. 多重扩增
避免探针、引物之间以及目标序列之间存在重叠序列。
设计探针时，确保每个目标序列有唯一的检测荧光基团。
根据实时荧光PCR仪的检测范围选择荧光基团，荧光报告基团的发射光谱不应重叠。
在单重反应中检测每组引物/探针组合，以设定一个基线标准，确保在多重PCR时Ct值相近。
高丰度的目标序列可搭配低强度荧光染料，低丰度的目标序列则搭配高强度荧光染料
6. 反转录
反转录步骤的反应温度一般建议按照试剂说明书设置。对于具有复杂二级结构或高GC含量的模板，建议提高反应温度，以提高扩增效率和灵敏度。
7. 循环条件
通常情况下，按照说明书中的循环条件即可获得最佳效果。
可以进行较长片段的扩增（>400 bp），但可能需要优化延伸时间。
对于大多数情况，40个循环是足够的；对于极低起始量的样本，可以进行45个循环。
8. 反应体系建立
为了获得最佳结果，在热循环前请将反应体系置于冰上。
对于96孔板，建议使用20 μl反应体系；对于384孔板，建议使用10 μl反应体系。
每个样本应设置三个重复，并确保每个扩增子包含阴性对照（NTC）。
为避免交叉污染，在热循环前加入热敏UDG（ATG #E205），在37℃下处理10分钟。
9. 检测与评估
确保至少三个10倍梯度稀释模板的扩增效率在90-110%之间，相关系数（R²）应大于0.99。
通过产物长度、测序或熔解曲线分析来确认其特异性。
