免疫组织化学（Immunohistochemistry，简称IHC）是一种利用抗原与抗体之间特异性结合的特性，通过化学反应使标记抗体的显色剂（如荧光素、酶、金属离子或同位素）显色，从而确定组织细胞内抗原（包括多肽和蛋白质）位置的技术。
实验流程01样本准备
IHC技术可应用于石蜡切片、冰冻切片以及细胞涂片的检测。尽管多数抗体适用于石蜡切片，且这些抗体通常也适用于冰冻切片和细胞涂片，但石蜡切片因其优越的组织形态结构和清晰的定位而成为实验室首选。本文将重点介绍石蜡切片的操作流程。
02组织固定
组织离体后，需立即进行固定处理，以最大限度保存组织细胞内的抗原成分和原始形态结构，防止抗原弥散。通常采用4%甲醛溶液（即10%福尔马林溶液，pH值7.2-7.4）作为固定液，固定液用量约为组织体积的10-20倍。固定效果可通过观察切面颜色判断，良好的固定应使切面呈现灰白色，质地坚硬且富有弹性。
03组织脱水与透明
固定后的组织需经过流水冲洗，以去除多余固定液和分解产物。随后进行脱水处理，逐步替换组织内的水分，以便后续石蜡浸透。脱水通常采用梯度乙醇溶液，从70%逐渐升至100%。脱水完成后，使用透明剂（如二甲苯）置换出乙醇，使组织变得透明，便于石蜡浸入。透明时间需根据组织大小适当调整，一般在30-60分钟之间。
04组织浸蜡与包埋
将透明后的组织浸入熔化的石蜡中（通常保持在60-62℃），浸透一定时间（一般为2-4小时）后，将组织置于包埋模具中，注入熔化的石蜡并冷却凝固。凝固后脱去模具，得到包埋好的组织块。
05切片与烤片
使用切片机将包埋好的组织块切成4-5μm厚的切片。切片展平后，先置于5%-10%乙醇中，再转移至恒温（40-46℃）水中。随后将切片贴片并放入60-65℃烤箱中烤片20-30分钟，或45℃烤片数小时，直至水分蒸发、石蜡熔化。烤好的切片可于4℃保存备用。
06抗原修复
为增强抗原与抗体的结合能力，常需进行抗原修复。热处理法是一种常用的抗原修复方法，包括水浴锅加热、微波炉加热或高压锅加热等。加热溶液多采用柠檬酸缓冲液（pH=6.0），加热条件需根据具体实验情况确定。
07内源性酶消除
为避免组织内源性过氧化物酶造成的假阳性结果，需使用3%过氧化氢水溶液处理切片15分钟，以消除内源性过氧化物酶活性。此步骤可在加一抗之前或之后进行。
08血清封闭
为减少非特异性背景干扰，需使用正常非免疫动物血清封闭组织中的非特异性结合位点。选择与二抗来源相同的正常血清进行封闭，封闭后无需PBS冲洗，直接弃去即可。
09抗体孵育
根据实验需求选择合适的一抗，并参考抗体说明书确定抗原修复条件。初次实验时，建议尝试不同抗体浓度以优化最佳浓度。将一抗滴加至切片上并孵育一定时间。
10显色与复染
常用的显色剂为3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB），它可在辣根过氧化酶（HRP）催化下与H2O2反应产生棕色沉淀。显色后需进行细胞核复染，常用复染剂为苏木素。复染后切片需经过脱水、透明处理，并用中性树胶封片保存。