荧光素酶报告基因（Luc）系统，依托荧光素为底物，巧妙检测萤火虫荧光素酶活性。此酶能催化荧光素氧化为oxyluciferin，过程中释放生物荧光，成为研究热点。
荧光素酶家族庞大，能催化多样底物发光，而哺乳细胞却无此内源酶。其中，细菌荧光素酶因热敏性在哺乳细胞研究中受限；萤火虫荧光素酶则凭借高灵敏度、宽检测范围（7-8个数量级），成为哺乳细胞研究的首选，尤其适合高通量筛选。更值得一提的是，新型萤火虫荧光素酶无需细胞裂解即可检测，大大简化了实验流程。而Renilla荧光素酶则以其产物能穿透生物膜的特性，展现出活细胞报告分子的潜力。
荧光素酶报告基因系统优势：
非放射性，安全环保；
反应迅速，超越CAT等传统报告基因；
灵敏度极高，是CAT的100倍；
半衰期短（哺乳细胞3小时，植物3.5小时），确保启动子变化即时反映为酶活性变化。
实验步骤如下：
生物信息学预测启动子转录因子结合位点。
PCR克隆靶启动子片段，插入pGL3-basic质粒。
筛选阳性克隆，测序验证后扩增提纯质粒。
同时准备转录因子质粒及空载对照质粒。
培养293等细胞至80%汇合度。
共转染报告基因质粒与转录因子表达质粒。
提取蛋白，进行荧光素酶检测。
加入底物，测定酶活性。
计算相对荧光强度，与空载对照比较。
具体操作流程（以萤火虫荧光素酶为例）：
消化接种细胞，过夜培养。
细胞密度达70%时，共转染报告基因质粒等。
转染后24-36小时，洗涤细胞。
加入harvest buffer裂解细胞。
准备反应液（ATP buffer:luciferin buffer=1:3.6）。
细胞裂解液与反应液混合，迅速测定吸光值。
测定LacZ活性作为内标校正。
数据分析，作图展示。
注意事项：
1. 荧光素酶检测试剂需预平衡至15-25℃。
2. 样品冰上保存5小时或-70℃长期保存，避免反复冻融。
3. 冷样品信号强度略降，高活性样品需稀释。
4. 稀释样品应立即使用，或加BSA至2.5mg/ml稳定。
5. 部分荧光仪需稳定1-2秒后再检测。
6. 荧光素酶报告基因系统以其独特优势，在细胞信号转导、基因表达调控等领域发挥着重要作用，是研究细胞生物学不可或缺的工具。
荧光素酶家族庞大，能催化多样底物发光，而哺乳细胞却无此内源酶。其中，细菌荧光素酶因热敏性在哺乳细胞研究中受限；萤火虫荧光素酶则凭借高灵敏度、宽检测范围（7-8个数量级），成为哺乳细胞研究的首选，尤其适合高通量筛选。更值得一提的是，新型萤火虫荧光素酶无需细胞裂解即可检测，大大简化了实验流程。而Renilla荧光素酶则以其产物能穿透生物膜的特性，展现出活细胞报告分子的潜力。
荧光素酶报告基因系统优势：
非放射性，安全环保；
反应迅速，超越CAT等传统报告基因；
灵敏度极高，是CAT的100倍；
半衰期短（哺乳细胞3小时，植物3.5小时），确保启动子变化即时反映为酶活性变化。
实验步骤如下：
生物信息学预测启动子转录因子结合位点。
PCR克隆靶启动子片段，插入pGL3-basic质粒。
筛选阳性克隆，测序验证后扩增提纯质粒。
同时准备转录因子质粒及空载对照质粒。
培养293等细胞至80%汇合度。
共转染报告基因质粒与转录因子表达质粒。
提取蛋白，进行荧光素酶检测。
加入底物，测定酶活性。
计算相对荧光强度，与空载对照比较。
具体操作流程（以萤火虫荧光素酶为例）：
消化接种细胞，过夜培养。
细胞密度达70%时，共转染报告基因质粒等。
转染后24-36小时，洗涤细胞。
加入harvest buffer裂解细胞。
准备反应液（ATP buffer:luciferin buffer=1:3.6）。
细胞裂解液与反应液混合，迅速测定吸光值。
测定LacZ活性作为内标校正。
数据分析，作图展示。
注意事项：
1. 荧光素酶检测试剂需预平衡至15-25℃。
2. 样品冰上保存5小时或-70℃长期保存，避免反复冻融。
3. 冷样品信号强度略降，高活性样品需稀释。
4. 稀释样品应立即使用，或加BSA至2.5mg/ml稳定。
5. 部分荧光仪需稳定1-2秒后再检测。
6. 荧光素酶报告基因系统以其独特优势，在细胞信号转导、基因表达调控等领域发挥着重要作用，是研究细胞生物学不可或缺的工具。
