一、实验设备与耗材方面
设备要求高
需要配备电泳仪、电泳槽等专业设备。电泳仪如果质量不佳或者使用不当，可能会导致电压不稳定，影响核酸在琼脂糖胶中的迁移速度，进而使核酸条带的分离效果变差。例如，当电泳过程中电压突然升高，核酸在凝胶中的迁移速度会过快，条带容易出现拖尾现象。
电泳槽如果清洁不到位，之前残留的核酸或者其他杂质可能会污染本次实验的样本，导致实验结果不准确。
耗材成本和质量问题
制作琼脂糖胶需要用到琼脂糖，其质量参差不齐。低质量的琼脂糖可能含有杂质，这些杂质会影响凝胶的透明度和均匀性。例如，含有较多多糖杂质的琼脂糖制作出的凝胶可能会有云雾状的不透明区域，干扰核酸条带的观察。
另外，购买的琼脂糖如果保存不当，如受潮，会影响其胶凝性能，使制成的凝胶强度不够，在电泳过程中容易破裂，导致样本泄漏，实验失败。同时，还需要购买合适的梳子来制作加样孔，梳子的规格不合适会导致加样孔形状不规则或孔径大小不一，影响加样的准确性。

二、操作过程方面
操作繁琐且易出错
制作琼脂糖胶需要精确称量琼脂糖和缓冲液。琼脂糖的用量不准确会影响凝胶的浓度。如果琼脂糖浓度过高，凝胶孔径过小，会阻碍大分子核酸的迁移，使大片段核酸无法有效分离；而浓度过低，凝胶孔径过大，小分子核酸可能会跑得太快，无法与其他成分很好地分离。例如，在进行 DNA 电泳时，想要分离大小在 1 - 10kb 之间的 DNA 片段，琼脂糖凝胶浓度一般在 0.8% - 1.2% 较为合适，偏差过大就会影响分离效果。
加热溶解琼脂糖的过程需要小心控制温度和时间。如果加热时间过长或者温度过高，琼脂糖溶液可能会沸腾溢出，造成浪费并且有烫伤的风险；同时，过度加热还可能会破坏琼脂糖的化学结构，影响凝胶的性能。在冷却琼脂糖溶液制作凝胶的过程中，需要避免产生气泡。气泡如果出现在凝胶中，会占据空间，使加样孔变形或者出现空缺，影响样本的正常加入和电泳过程。
存在安全隐患
在加热琼脂糖和缓冲液的过程中，使用微波炉或者加热板等设备，存在烫伤的危险。特别是使用微波炉加热时，由于无法直接观察内部溶液的状态，当打开微波炉门时，可能会有热的溶液溅出。另外，在配置缓冲液（如 TAE 或 TBE 缓冲液）时，需要使用一些化学试剂，如 Tris 碱、硼酸、EDTA 等，这些试剂有些是有腐蚀性的，如果不小心接触到皮肤或者眼睛，会造成伤害。

三、实验结果方面
结果稳定性和准确性相对较差
自制的琼脂糖胶在凝胶的均一性上可能不如商业化生产的预制胶。由于手工制作过程中难以保证琼脂糖溶液完全均匀，可能会导致凝胶不同区域的孔径略有差异，使得核酸在凝胶中的迁移速度不一致，同一大小的核酸条带在不同位置的迁移距离不同，影响对核酸大小判断的准确性。
而且自己制作的凝胶在保存条件上较难达到理想状态，如在保存过程中可能会因为温度变化、水分蒸发等因素导致凝胶干裂或者变形，从而影响后续的实验使用和结果的稳定性。
检测范围有限
对于一些特殊要求的核酸检测，如高分辨率的小片段核酸分离或者超大片段核酸（如大于 50kb）的分离，自己制作的琼脂糖胶可能无法满足要求。因为制作高分辨率的凝胶需要更精确地控制凝胶浓度、缓冲液成分等多个因素，而这些对于一般的自制条件来说比较困难。例如，要分离小于 100bp 的小片段核酸，需要使用高浓度的琼脂糖凝胶（如 3% - 4%）和特殊的缓冲液，自己制作时很难达到这样的精度。