一、细胞增殖实验
细胞增殖、细胞凋亡以及细胞周期等，作为肿瘤研究的关键表征，一直是分子生物学与药理学领域亟待解决的重要课题。研究者们通过过表达或干扰细胞中的特定基因，来探究这些基因对细胞增殖能力的影响，从而进一步揭示基因的功能。同时，他们也会利用药物处理细胞，以观察药物对细胞增殖的调控作用。
1. MTT检测法：这是一种评估细胞存活与生长状况的有效手段。该方法在生物活性因子活性测定、抗肿瘤药物筛选、细胞毒性评估以及肿瘤放射敏感性检测等方面得到了广泛应用。其显著特点在于灵敏度高、成本经济且操作快捷。
原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够催化外源性的MTT还原为不溶于水的蓝紫色甲瓒（Formazan）晶体，并沉积在细胞内。而死亡的细胞则不具备这一能力。二甲基亚砜（DMSO）能够溶解细胞内的甲瓒，通过酶联免疫检测仪在490纳米波长下测定其吸光度，从而间接反映活细胞的数量。在一定范围内，MTT结晶的形成量与细胞数量呈正比关系。
2. CCK-8检测法：此方法可用于简便且精确地分析细胞增殖与毒性，广泛应用于药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性评估以及肿瘤药敏试验等领域。
原理：该试剂含有WST-8成分（化学名为2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-H-四唑单钠盐），在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的催化下，被细胞内的脱氢酶还原为高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒数量与活细胞数量成正比，因此可直接用于细胞增殖与毒性的分析。
3. Brdu法：即5-溴脱氧尿嘧啶核苷法，作为胸腺嘧啶的衍生物，可在DNA合成期（S期）替代胸腺嘧啶，通过活体注射或细胞培养方式加入。随后利用抗Brdu单克隆抗体进行ICC染色，以显示增殖细胞。结合其他细胞标记物的双重染色，可进一步判断增殖细胞的类型、增殖速度，对细胞动力学研究具有重要意义。
然而，由于抗体分子量大，难以掺入并被有效检测，因此BrdU检测需采用DNA酶、HCl处理或加热使DNA变性。这些处理方法可能破坏抗原识别位点，且许多细胞周期分析染料需依赖双链DNA（dsDNA）。这导致同一样本无法同时进行细胞周期分析。对于植物细胞等具有细胞壁的分析对象，抗体检测还需消化细胞壁，而细胞壁消化酶中的杂质可能影响检测可靠性。此外，BrdU检测还需长时间孵育，可能长达数小时甚至过夜。
4. EDU法：即5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶法，作为一种胸腺嘧啶核苷类似物，能在细胞增殖期替代胸腺嘧啶（T）掺入正在复制的DNA分子中。基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应，可快速检测细胞DNA复制活性，适用于细胞增殖、分化、生长与发育、DNA修复、病毒复制及细胞标记示踪等研究领域，尤其适用于siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验。
二、细胞凋亡实验
细胞凋亡作为肿瘤与发育研究的焦点，同时也是药理学研究的热点话题。它指的是细胞在特定生理或病理条件下，遵循自身程序主动结束生命的过程。这一过程是主动的、高度有序的，并受基因控制，涉及一系列酶的参与。
细胞凋亡的过程大致可划分为接受凋亡信号、凋亡调控分子间相互作用、蛋白水解酶（如Caspase）活化以及进入连续反应阶段。
ANNEXIN V-PI检测法：在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）仅分布于细胞膜脂质双层的内侧。而在细胞凋亡早期，PS会翻转至细胞膜外侧。Annexin V作为一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与PS具有高度亲和力，因此能与凋亡早期细胞的外膜结合。这使得Annexin V成为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。
通过将Annexin V进行荧光素（如EGFP、FITC）标记，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（PI）作为一种核酸染料，无法透过完整的细胞膜，但能透过凋亡中晚期细胞及死细胞的细胞膜，使细胞核染红。因此，将Annexin V与PI联合使用，可区分处于不同凋亡阶段的细胞。
三、细胞迁移与侵袭实验
在肿瘤发展过程中，细胞进入循环系统的能力是一个重要的研究方面。相关信号通路主要涉及细胞黏附与细胞骨架的调控。细胞的迁移与侵袭能力与细胞骨架和黏附特性密切相关。肿瘤细胞的侵袭与迁移能力变化通常通过Transwell实验进行检测。而细胞划痕实验也是评估肿瘤细胞运动特性的一种方法，但由于无法区分正常增殖与迁移细胞，其应用受到一定限制。
1. Transwell实验：
Transwell小室底部设有一张通透性的膜（多为聚碳酸酯膜），置于孔板中，形成上室与下室。由于膜的通透性，下室培养液中的成分可影响上室内细胞。利用Transwell可研究下室培养液成分对细胞生长、运动等的影响。
肿瘤迁移实验：用于评估肿瘤细胞的迁移能力或在特定条件下的迁移能力。常采用8.0、12.0µm的膜，上室种植肿瘤细胞，下室加入胎牛血清（FBS）或特定趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分丰富的下室迁移。通过计数进入下室的细胞数量，可反映肿瘤细胞的迁移能力。
肿瘤侵袭实验：用于评估肿瘤细胞的侵袭能力或在特定条件下的侵袭能力。在聚碳酸酯膜上涂覆一层基质胶，模拟细胞外基质环境，上室种植肿瘤细胞，下室加入FBS或特定趋化因子。细胞需消化基质后才能从上室迁移至下室，通过计数进入下室的细胞数量来测定细胞的侵袭能力。
实验目的：探究目的基因过表达/干扰对细胞侵袭、转移能力的影响。
实验材料：正常细胞、对照慢病毒、过表达基因慢病毒。
实验步骤：细胞复苏→Transwell铺板→细胞培养及染色→拍照记录。
2. 划痕实验：
划痕实验检测细胞迁移的原理在于，在体外培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或其他硬物在细胞生长区域划线，去除中央部分的细胞，然后继续培养至设定时间。通过显微镜下观察并拍照记录特定位置细胞的生长迁移情况，以评估细胞的迁移与修复能力。
实验通常设置正常对照组与实验组，实验组会加入某种处理因素、药物或外源性基因等。通过比较不同组别细胞对划痕区的修复能力，可判断各组细胞的迁移与修复能力差异。
四、细胞克隆实验
1、实验目的：通过对比目的基因过表达/干扰细胞组、空细胞组与阴性对照组（空病毒）的克隆形成数量，进行统计学分析，以研究特定基因对细胞群体依赖性和增殖能力的影响。
2、实验材料：病毒（携带目的基因或空载体）、细胞株（目标细胞系）。
3、实验步骤：
1）铺板：将细胞分散成单细胞悬液，以适当的密度接种于培养皿中。
2）细胞培养：将接种后的培养皿置于适宜的培养条件下（如37℃、5% CO₂培养箱）进行培养，持续一周以上。
3）观察克隆：定期检查细胞生长情况，当细胞形成克隆时（一般大小在0.3 - 1.0mm之间，含有50个以上的细胞），终止培养。
4） 染色与计数：对培养皿中的细胞进行染色（如使用姬姆萨染液），然后在显微镜下计数克隆数量，计算克隆形成率。
4、结果分析：对比各组克隆形成率，进行统计学分析，评估基因对细胞增殖和群体依赖性的影响。
五、细胞粘附实验
1、实验原理：细胞粘附性是维持组织结构稳定、调节细胞运动和发挥功能的重要因素，对细胞的增殖和分化有重要影响。本实验通过检测细胞在人工基底膜胶上的粘附能力，来评估细胞的粘附性。
2、实验材料：Hep3B细胞、 Lipofectamine™ 2000转染试剂、37LRP siRNA、无血清MEM培养基、Matrigel（人工基底膜胶）、 胰酶、姬姆萨染液。
3、实验步骤：
1） 细胞传代：将Hep3B细胞以4.5×10⁵个/孔传代于6孔培养板中。
2） 细胞转染：使用Lipofectamine™ 2000将37LRP siRNA转染入Hep3B细胞，同时设置阴性对照转染和未转染的细胞作为对照。
3） 细胞收集：转染48小时后，用胰酶消化细胞并制成单细胞悬液。
4） 人工基底膜胶制备：用无血清MEM培养基将Matrigel配制成10ug/250ul的人工基底膜胶。
5） 铺胶：在96孔板中每孔铺入2ug/50ul的Matrigel，风干过夜。
6） 细胞接种：将转染、阴性对照转染及未转染的Hep3B细胞以4×10³/孔接种在铺有Matrigel的96孔板中，设置3个重复孔。
7） 细胞培养与粘附：将96孔板置于37℃、5% CO₂培养箱中分别培养20min、40min、60min。
8） 细胞固定与染色：取出96孔板，吸出培养液，用PBS洗去未粘附的细胞，然后用甲醇固定并用姬姆萨染液染色。
9） 细胞计数：在显微镜下计数粘附的细胞数量，每孔在固定位置取8个视野进行计数。
4、结果分析：对比各组细胞粘附数量，评估37LRP基因对Hep3B细胞粘附性的影响。
细胞增殖、细胞凋亡以及细胞周期等，作为肿瘤研究的关键表征，一直是分子生物学与药理学领域亟待解决的重要课题。研究者们通过过表达或干扰细胞中的特定基因，来探究这些基因对细胞增殖能力的影响，从而进一步揭示基因的功能。同时，他们也会利用药物处理细胞，以观察药物对细胞增殖的调控作用。
1. MTT检测法：这是一种评估细胞存活与生长状况的有效手段。该方法在生物活性因子活性测定、抗肿瘤药物筛选、细胞毒性评估以及肿瘤放射敏感性检测等方面得到了广泛应用。其显著特点在于灵敏度高、成本经济且操作快捷。
原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够催化外源性的MTT还原为不溶于水的蓝紫色甲瓒（Formazan）晶体，并沉积在细胞内。而死亡的细胞则不具备这一能力。二甲基亚砜（DMSO）能够溶解细胞内的甲瓒，通过酶联免疫检测仪在490纳米波长下测定其吸光度，从而间接反映活细胞的数量。在一定范围内，MTT结晶的形成量与细胞数量呈正比关系。
2. CCK-8检测法：此方法可用于简便且精确地分析细胞增殖与毒性，广泛应用于药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性评估以及肿瘤药敏试验等领域。
原理：该试剂含有WST-8成分（化学名为2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-H-四唑单钠盐），在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的催化下，被细胞内的脱氢酶还原为高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒数量与活细胞数量成正比，因此可直接用于细胞增殖与毒性的分析。
3. Brdu法：即5-溴脱氧尿嘧啶核苷法，作为胸腺嘧啶的衍生物，可在DNA合成期（S期）替代胸腺嘧啶，通过活体注射或细胞培养方式加入。随后利用抗Brdu单克隆抗体进行ICC染色，以显示增殖细胞。结合其他细胞标记物的双重染色，可进一步判断增殖细胞的类型、增殖速度，对细胞动力学研究具有重要意义。
然而，由于抗体分子量大，难以掺入并被有效检测，因此BrdU检测需采用DNA酶、HCl处理或加热使DNA变性。这些处理方法可能破坏抗原识别位点，且许多细胞周期分析染料需依赖双链DNA（dsDNA）。这导致同一样本无法同时进行细胞周期分析。对于植物细胞等具有细胞壁的分析对象，抗体检测还需消化细胞壁，而细胞壁消化酶中的杂质可能影响检测可靠性。此外，BrdU检测还需长时间孵育，可能长达数小时甚至过夜。
4. EDU法：即5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶法，作为一种胸腺嘧啶核苷类似物，能在细胞增殖期替代胸腺嘧啶（T）掺入正在复制的DNA分子中。基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应，可快速检测细胞DNA复制活性，适用于细胞增殖、分化、生长与发育、DNA修复、病毒复制及细胞标记示踪等研究领域，尤其适用于siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验。
二、细胞凋亡实验
细胞凋亡作为肿瘤与发育研究的焦点，同时也是药理学研究的热点话题。它指的是细胞在特定生理或病理条件下，遵循自身程序主动结束生命的过程。这一过程是主动的、高度有序的，并受基因控制，涉及一系列酶的参与。
细胞凋亡的过程大致可划分为接受凋亡信号、凋亡调控分子间相互作用、蛋白水解酶（如Caspase）活化以及进入连续反应阶段。
ANNEXIN V-PI检测法：在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）仅分布于细胞膜脂质双层的内侧。而在细胞凋亡早期，PS会翻转至细胞膜外侧。Annexin V作为一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与PS具有高度亲和力，因此能与凋亡早期细胞的外膜结合。这使得Annexin V成为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。
通过将Annexin V进行荧光素（如EGFP、FITC）标记，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（PI）作为一种核酸染料，无法透过完整的细胞膜，但能透过凋亡中晚期细胞及死细胞的细胞膜，使细胞核染红。因此，将Annexin V与PI联合使用，可区分处于不同凋亡阶段的细胞。
三、细胞迁移与侵袭实验
在肿瘤发展过程中，细胞进入循环系统的能力是一个重要的研究方面。相关信号通路主要涉及细胞黏附与细胞骨架的调控。细胞的迁移与侵袭能力与细胞骨架和黏附特性密切相关。肿瘤细胞的侵袭与迁移能力变化通常通过Transwell实验进行检测。而细胞划痕实验也是评估肿瘤细胞运动特性的一种方法，但由于无法区分正常增殖与迁移细胞，其应用受到一定限制。
1. Transwell实验：
Transwell小室底部设有一张通透性的膜（多为聚碳酸酯膜），置于孔板中，形成上室与下室。由于膜的通透性，下室培养液中的成分可影响上室内细胞。利用Transwell可研究下室培养液成分对细胞生长、运动等的影响。
肿瘤迁移实验：用于评估肿瘤细胞的迁移能力或在特定条件下的迁移能力。常采用8.0、12.0µm的膜，上室种植肿瘤细胞，下室加入胎牛血清（FBS）或特定趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分丰富的下室迁移。通过计数进入下室的细胞数量，可反映肿瘤细胞的迁移能力。
肿瘤侵袭实验：用于评估肿瘤细胞的侵袭能力或在特定条件下的侵袭能力。在聚碳酸酯膜上涂覆一层基质胶，模拟细胞外基质环境，上室种植肿瘤细胞，下室加入FBS或特定趋化因子。细胞需消化基质后才能从上室迁移至下室，通过计数进入下室的细胞数量来测定细胞的侵袭能力。
实验目的：探究目的基因过表达/干扰对细胞侵袭、转移能力的影响。
实验材料：正常细胞、对照慢病毒、过表达基因慢病毒。
实验步骤：细胞复苏→Transwell铺板→细胞培养及染色→拍照记录。
2. 划痕实验：
划痕实验检测细胞迁移的原理在于，在体外培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或其他硬物在细胞生长区域划线，去除中央部分的细胞，然后继续培养至设定时间。通过显微镜下观察并拍照记录特定位置细胞的生长迁移情况，以评估细胞的迁移与修复能力。
实验通常设置正常对照组与实验组，实验组会加入某种处理因素、药物或外源性基因等。通过比较不同组别细胞对划痕区的修复能力，可判断各组细胞的迁移与修复能力差异。
四、细胞克隆实验
1、实验目的：通过对比目的基因过表达/干扰细胞组、空细胞组与阴性对照组（空病毒）的克隆形成数量，进行统计学分析，以研究特定基因对细胞群体依赖性和增殖能力的影响。
2、实验材料：病毒（携带目的基因或空载体）、细胞株（目标细胞系）。
3、实验步骤：
1）铺板：将细胞分散成单细胞悬液，以适当的密度接种于培养皿中。
2）细胞培养：将接种后的培养皿置于适宜的培养条件下（如37℃、5% CO₂培养箱）进行培养，持续一周以上。
3）观察克隆：定期检查细胞生长情况，当细胞形成克隆时（一般大小在0.3 - 1.0mm之间，含有50个以上的细胞），终止培养。
4） 染色与计数：对培养皿中的细胞进行染色（如使用姬姆萨染液），然后在显微镜下计数克隆数量，计算克隆形成率。
4、结果分析：对比各组克隆形成率，进行统计学分析，评估基因对细胞增殖和群体依赖性的影响。
五、细胞粘附实验
1、实验原理：细胞粘附性是维持组织结构稳定、调节细胞运动和发挥功能的重要因素，对细胞的增殖和分化有重要影响。本实验通过检测细胞在人工基底膜胶上的粘附能力，来评估细胞的粘附性。
2、实验材料：Hep3B细胞、 Lipofectamine™ 2000转染试剂、37LRP siRNA、无血清MEM培养基、Matrigel（人工基底膜胶）、 胰酶、姬姆萨染液。
3、实验步骤：
1） 细胞传代：将Hep3B细胞以4.5×10⁵个/孔传代于6孔培养板中。
2） 细胞转染：使用Lipofectamine™ 2000将37LRP siRNA转染入Hep3B细胞，同时设置阴性对照转染和未转染的细胞作为对照。
3） 细胞收集：转染48小时后，用胰酶消化细胞并制成单细胞悬液。
4） 人工基底膜胶制备：用无血清MEM培养基将Matrigel配制成10ug/250ul的人工基底膜胶。
5） 铺胶：在96孔板中每孔铺入2ug/50ul的Matrigel，风干过夜。
6） 细胞接种：将转染、阴性对照转染及未转染的Hep3B细胞以4×10³/孔接种在铺有Matrigel的96孔板中，设置3个重复孔。
7） 细胞培养与粘附：将96孔板置于37℃、5% CO₂培养箱中分别培养20min、40min、60min。
8） 细胞固定与染色：取出96孔板，吸出培养液，用PBS洗去未粘附的细胞，然后用甲醇固定并用姬姆萨染液染色。
9） 细胞计数：在显微镜下计数粘附的细胞数量，每孔在固定位置取8个视野进行计数。
4、结果分析：对比各组细胞粘附数量，评估37LRP基因对Hep3B细胞粘附性的影响。
