揭示美国圈养老虎的基因组多样性和进化历史（2024）
在这项研究中，我们使用基因组测序来调查美国私人圈养老虎种群的多样性。私人圈养的老虎数量远远超过了野生老虎和动物园认可的老虎数量，这使它们成为未来保护工作的重要考虑因素。我们的研究表明，圈养种群既不是近亲繁殖的，也不是高度多样化的，尽管其祖先来自所有六个现存的野生虎亚种。我们附带的参考小组可以使用超低覆盖率的基因组数据快速分配祖先并单独识别老虎，为其他更昂贵、更耗时的方法提供了一种经济高效、计算高效的替代方案，并可用于支持老虎的现场监测和管理决策。
濒危物种的基因组研究主要集中在描述多样性模式和解决系统发育关系上，其首要目标是为保护工作提供信息。然而，很少有研究调查圈养种群中的基因组多样性。对于老虎（Panthera tigris）来说，圈养的个体数量远远超过野生个体，但它们的多样性在很大程度上仍未得到探索。私人拥有的圈养老虎种群在保护界仍然是一个谜，一些人认为这些个体是严重近亲繁殖的，而另一些人则认为它们可能是现已灭绝的多样性的来源。在这里，我们对美国私人（非动物园）圈养的老虎种群进行了大规模的遗传研究，也称为“通用”老虎。我们发现，通用虎种群具有混合基因，包括所有六个现存的野生虎亚种。在为本研究目的测序的138个属个体中，没有一个个体的祖先仅来自一个亚种。我们发现，与大多数野生亚种相比，通用虎种群具有相当数量的遗传多样性，很少有私有变异，有害突变也较少。我们观察到近亲繁殖系数与野生种群相似，尽管在普通种群和野生种群中都有一些个体基本上是近亲繁殖的。此外，我们开发了一个老虎参考面板，可以与归因一起使用，以准确区分个体并使用超低覆盖率（0.25 倍）数据分配血统。通过提供全基因组测序（WGS）的成本效益高的替代方案，参考小组提供了一种资源，以协助迁地和就地种群的老虎保护工作。

老虎（Panthera tigris）是地球上最具标志性和吸引力的陆地物种之一，是威胁许多物种生存的种群规模和连通性严重快速下降的例证1。至少在过去的10000年里，老虎有六个现存亚种（东北虎、孟加拉虎、印支虎、马来虎、华南虎和苏门答腊虎）在遗传和地理上基本上是分开的。亚种分别分布在俄罗斯远东和中国东北部（P.t.altaica）、孟加拉国、不丹、印度和尼泊尔（P.t.tigris）、缅甸、泰国和老挝（P.t.corbetti）、苏门答腊岛（P.t.sumatrae）和马来半岛（P.t.jacksoni），而华南虎（P.t.amoyensis）已在野外灭绝。尽管一些老虎种群和亚种从最近的恢复工作中受益，但由于人类的压力，其他老虎已经在野外灭绝或完全灭绝。在上个世纪，所有亚种都经历了严重的种群瓶颈，主要是由于狩猎和农业扩张等人类活动，这些活动直接减少了老虎的数量、栖息地的可用性和猎物。
除了野生种群外，还有几个圈养的老虎种群。一些圈养种群受到监管，如世界动物园和水族馆协会（WAZA）所涵盖的种群，而另一些种群则大多不受监管，如养殖和其他私有老虎。在美国，动物学联合会（AZA）将几个老虎种群作为不同的亚种进行管理，特别是东北虎（20世纪50年代至今）、苏门答腊虎（50世纪50年代迄今）、马来亚虎（80年代至今），以及一段时间内的“孟加拉虎”（白虎；20世纪60年代-2011年）老虎亚种。AZA终止了白虎（“孟加拉虎”）的繁殖计划，因为一种单一的变种负责产生白色表型（在野生孟加拉虎种群中自然发生，但很少发生），并且繁殖被确定与保护计划无关。此外，在该计划终止之前，为了防止近亲繁殖衰退，该种群被故意与东北虎杂交。在AZA动物园之外，个人和实体合法和非法地繁殖、拥有和出售老虎，直到最近通过了联邦立法（大猫公共安全法案），以前对这些做法几乎没有监督。美国私有圈养种群的形成可能与20世纪初动物园和马戏团的建立相吻合，因为这些实体以交换个体而闻名。随着时间的推移，AZA动物园的使命开始与马戏团和其他私有制做法背道而驰，但到21世纪初，估计美国圈养的老虎数量超过5000只。

私人拥有的老虎种群的繁殖速度引发了人们对近亲繁殖的担忧，特别是因为依赖罕见隐性突变的表型（即条纹白虎、雪白虎和金虎）被认为具有很高的经济价值。之前的一项研究使用线粒体DNA（mtDNA）和微卫星记录了来自不同地区的圈养、私有老虎的混合特征，并表明与野生和圈养的单一血统对手相比，这组个体可能具有独特的多样性。随着濒危物种越来越频繁地实施遗传救援、易位和圈养繁殖计划以进行战略管理，对圈养种群内遗传多样性的更广泛理解，包括混合和近亲繁殖的对立力量，值得进一步调查。目前尚不清楚如此庞大的私有圈养老虎种群如何或是否可能纳入当前的管理或保护计划，和/或它们的基因组是否具有这种所谓的独特多样性，或者另一方面，它们是否显示出严重近亲繁殖或高突变量的迹象。圈养和野生种群中老虎基因组多样性的基线将有助于跟踪野生老虎的恢复情况，做出有关野化的管理决策，并确定非法交易的个体和材料的来源种群。

在这里，我们使用基因组数据，利用从认证保护区中的个体获得的全基因组序列数据，重建美国圈养的私有老虎种群（也称为“通用”老虎）的混合历史。这些保护区不繁殖、出售或购买老虎，而是收容以前从这些设施中救出的老虎或被私人所有者没收的老虎。我们将新测序的个体（N=151）与之前发表的单亚种祖先老虎的数据（N=105）相结合，得到一个代表所有六个现存亚种和美国通用老虎的256个独特个体的数据集。我们的数据集由（N=69）个高覆盖率（>10×）和（N=187）个低覆盖率（<10×）的个体组成。这些数据使我们能够确定混合如何塑造私人圈养种群的基因组景观。我们将通用虎与其潜在的来源种群（单一祖先的老虎，即亚种）进行比较，并研究每个群体的多样性是如何划分的。然后，我们测试近亲繁殖的潜在迹象，并量化每个种群中有害变异的总量。最后，我们表明，使用单祖先老虎的参考单倍型可以充分估算超低覆盖率（0.25×）数据，以识别祖先并进行个体识别。我们的研究结果表明，低覆盖率测序和插补提供了一种具有成本效益的替代方案，可以识别非法交易的个体或老虎野生动物材料的来源种群，并对圈养和野生种群进行长期监测。
在常规兽医护理期间，兽医和保护区工作人员从保护区设施（补充表1）随机收集了155只老虎样本。所有样品均使用Qiagen DNeasy试剂盒（目录号69504）提取，样品使用改良的Nextera文库制备方案制备26。其中78个样本（在补充数据1中列为“未计算”）的测序深度约为2×至5×。其余77个样本（补充数据1中的“计算”）的测序约为0.25×。为了本手稿的目的，在避难所收集的或祖先未知的老虎被标记为“通用”。我们还从北美的保护区收集了每只老虎出生地点的数据。这些地点随后被转换为六个地区之一：西部（华盛顿州、俄勒冈州、加利福尼亚州、内华达州、蒙大拿州、爱达荷州、怀俄明州、科罗拉多州、犹他州）、西南部（亚利桑那州、新墨西哥州、德克萨斯州、俄克拉荷马州）、中西部（北达科他州、南达科他州、内布拉斯加州、堪萨斯州、明尼苏达州、爱荷华州、密苏里州、威斯康星州、伊利诺伊州、密歇根州、印第安纳州、俄亥俄州）、东南部（阿肯色州、路易斯安那州、田纳西州、密西西比州、阿拉巴马州、乔治亚州、佛罗里达州、肯塔基州、西弗吉尼亚州、弗吉尼亚州、北卡罗来纳州、南卡罗来纳州）和东北部（缅因州、新罕布什尔州、马萨诸塞州、纽约州、宾夕法尼亚州、马里兰州、特拉华州、康涅狄格州、佛蒙特州、罗德岛州、新泽西州）和加拿大。

我们使用主成分分析（PCA）、监督混合、线粒体单倍型和当地祖先片段的组合，研究了通用虎的种群结构和祖先。监督下的ADMIXTURE分析（图1A和补充注释）和PCA（补充图1）都表明，通用虎在六个现存虎亚种之间混合，每个祖先种群的基因组比例各不相同（图1A）。这一结果也反映在他们的线粒体单倍型中（补充图2-4），在检查当地血统时更为广泛（补充图5）。我们没有发现有单一亚种血统的通用虎。平均而言，一般个体主要混合在东北虎和孟加拉虎亚种之间（平均值：分别有38.6%和28.2%的祖先来自每个亚种），而苏门答腊虎和马来虎种群的祖先最少（平均值分别为5.0%和11.1%；图1A）。我们的聚类分析和PCA结果表明，圈养种群在PC空间和状态同一性（IBS）树中按其显性祖先聚集在一起（图1B；补充图6C）。我们还观察到一些基于北美假定的地理起源的聚类（图1C），尽管它比按血统聚类更难区分。这些结果表明，通用种群的结构主要是由建立圈养种群的繁殖事件引起的，后续的地理结构证据不足。我们根据线粒体单倍型结果看到了历史混合的进一步证据，其中通用个体与东北虎、印度支那虎和孟加拉虎亚种聚集在一起。在线粒体单倍型分析中，我们只观察到一个通用样本（SRR836354）与马来虎分组，没有与苏门答腊虎或华南虎分组（补充图2-4）。更多信息见补充说明。有趣的是，我们的分析还确定了几个以前被标记为单祖先亚种的个体是通用个体。这些个体最初在公共存储库中被标记为东北虎（SRR7651464-67，SRR7651470）和孟加拉（SRR836354）亚种，但我们观察到，根据PCA（补充图17）和随后的混合分析（图1A），它们都有混合的祖先背景。这些个体缺乏额外的元数据，但被认为起源于亚洲（补充表1），因此在混合图中被标记为“亚洲”（图1A）。

利用256只老虎的全基因组数据，我们调查了美国私人所有的、通用的、圈养的老虎种群的多样性和祖先，以及它们与老虎的六个亚种的比较。此外，我们还为老虎建立了一个参考面板，可用于推断低覆盖率数据，可靠地区分个体，甚至在超低覆盖率（0.25倍及以上）下也能确定个体血统。我们发现，从美国采集的所有老虎都是杂交的，大多数都有来自所有现存虎亚种的祖先（图1A）。此外，我们在源自亚洲的公共数据存储库中发现了几个老虎基因组，这些基因组被错误地识别为具有单一老虎亚种的祖先（图1A，补充图17-18，补充注释）。大多数属虎的大部分祖先来自东北虎和孟加拉虎亚种（图1A），但个体来自任何一个亚种的祖先比例各不相同（图1A，补充图5）。当地祖先片段的长度分布（补充图5）表明，现存的美国通用虎种群中可能很少有直接来自最近引入的单一祖先来源的个体。我们的发现与Luo2008年的研究结果不同，后者使用微卫星和线粒体数据来调查1982年至2002年间从14个国家（包括美国）获得的圈养老虎样本；并发现，在圈养条件下测试的个体中，几乎有一半被分配到单亚种血统。Luo及其同事（2008）没有详细描述采样个体的起源，但在收集这些样本时，单亚种血统的个体可能正积极融入私人圈养的老虎种群。或者，先前研究中使用的少量微型卫星可能在区分通用虎的复杂祖先方面具有相对有限的能力。有趣的是，Luo及其同事（2008）发现，具有混合亚种血统的圈养老虎主要来自印支虎系，而这里分析的老虎主要来自东北虎和孟加拉虎系。来自不同国家的圈养非动物园个体的额外基因组将提供有关老虎祖先比例是否是区分大陆或特定国家老虎种群的有用基因的见解，可用于野生动物调查。
关于圈养种群（动物园和通用虎）如何为保护做出贡献，特别是它们是否含有有利于物种生存的独特等位基因，一直存在讨论。虽然毫无疑问，由于圈养的个体数量（即种群普查规模），通用虎种群携带了一些独特的变异，但我们在这里表明，该种群并不比单一祖先种群包含更多或更多的独特遗传变异（图2，补充图7-8）。换句话说，通用虎具有平均杂合度（图2B），很少有独特的分离位点（补充图7-8），与其他亚种相比，通用种群中分离的大多数位点也在野生种群中分离（图2A）。虽然在通用群体中可能存在一些有益的等位基因，但预测哪些位点是适应性的，即使是研究最充分的物种也是一项具有挑战性的任务，实施基于基因的管理策略也可能带来有害的副作用。与野生种群相比，通用种群包含较少的有害隐性纯合变异和相对较低的C类ROH含量（图3和图4）。考虑到普通种群的混合程度，有害突变的频率较低是可以预料的，但考虑到“养殖”老虎的所谓近亲繁殖，这还是令人惊讶的。因此，在这种情况下，普通老虎之间的混合对基因组景观的影响并不明显。杂合性和负载在其他亚种和属群中是相似的，这可能是由于不同谱系之间的混合增加了杂合性的复合效应，随后是重复建立事件和故意近亲繁殖的严重瓶颈。在泛型中观察到的混合结果是偶然的结果，但不一定能预测近亲繁殖、负载或杂合度的其他指标，也不能否定远亲繁殖的可能影响，我们在这里没有研究过。这一结果也在人群中观察到，特别是在混合的拉丁美洲创始种群中。一些著名的动物园种群，如长颈鹿和猩猩，已经从多个基因上不同的种群、亚种或物种中为圈养繁殖项目采购了动物。如果我们继续将圈养种群视为野生物种的多样性库，那么对这些过程（混合、近亲繁殖与远系繁殖抑制）的潜在结果和相互作用进行额外调查是极其重要的。我们进一步警告说，有害变异分析，特别是在非模型生物中，应该持怀疑态度。有害变异分析通常依赖于其他生物体的注释和对祖先状态的准确推断，即使在研究最充分的模型生物体中，这两种分析也可能是不精确的。在我们有办法更自信地将变异与其在野外的功能后果联系起来之前，应该极其谨慎地将这些信息整合到管理计划中。

本研究的最后一个目的是编制一个参考数据集和归纳面板，能够识别未知个体的祖先。我们的小组研究成果已经被证明是有用的，因为我们发现，几只被公开认定为单一祖先的老虎实际上是在几个亚种之间混合的（见补充信息，图1A，补充图16-17）。随着更多老虎基因组的测序和老虎基因组测序的改进，这里开发的老虎参考数据库可以更新以提高其准确性。我们研究中的参考数据集和归纳流程提供了一种强大的方法，即使从覆盖率非常低的样本中，也能快速且经济高效地识别个体及其祖先。总的来说，我们的分析与老虎亚种在历史瓶颈和最近近亲繁殖方面的已知历史是一致的，但我们也揭示了美国大量通用老虎的独特历史，并提供了所有现存亚种和可用数据的全面概述。大多数通用虎的基因组中都包含所有六种野生虎亚种的祖先。与之前的直觉相反，大多数通用虎没有表现出严重的近亲繁殖迹象，也没有独特的多样性。因此，它们在保护中可能发挥的作用（如果有的话）还有待观察。事实上，对单一血统圈养种群的进一步调查将进一步阐明可用于老虎保护的遗传资源以及这些独特圈养种群形成的原因。然而，这个通用种群是独特的进化混合事件的产物，这可能有助于我们更好地理解未来混合不同野生谱系的后果。为了鼓励未来的研究并协助非法贸易和贩运调查，我们还提供了一个参考小组，该小组可以使用超低覆盖率测序快速识别老虎及其祖先。总的来说，我们的研究结果不仅为老虎的保护管理提供了信息，而且为保护界的其他人在使用低覆盖率测序识别个体及其祖先起源时生成参考小组提供了一条具有成本效益的路径。

个人分析和总结：
1.私人圈养的老虎数量远远超过了野生老虎和动物园认可的老虎数量；
2.到21世纪初，估计美国圈养的老虎数量超过5000只；
4.在全美国（部分加拿大）随机抽取私有圈养256只老虎的全基因组数据进行研究，老虎全部是杂交种群；
5.平均而言，一般个体主要混合在东北虎和孟加拉虎亚种之间（平均值：分别有38.6%和28.2%的祖先来自每个亚种），而苏门答腊虎和马来虎种群的祖先最少（平均值分别为5.0%和11.1%）；
6.白虎来自孟加拉虎（20世纪60年代-2011年）亚种。因为繁殖被确定与保护计划无关，AZA（美国动物学联合会）终止了白虎的繁殖计划（在野生孟加拉虎种群中自然发生，但很少发生）。在该计划终止之前，为了防止近亲繁殖衰退，该种群被故意与东北虎杂交；
6.与野生种群相比，美国的私有圈养种群包含较少的有害隐性纯合变异和相对较低的C类ROH含量。考虑到这些种群的混合程度，有害突变的频率较低是可以预料的；
7.该研究结果因为采用了最新的基因测序法，推翻了Luo及其同事（2008）之前的结果。