通过COI DNA进行粪便分析，揭示马来西亚半岛濒危野生马来虎的猎物偏好（2024)
了解马来西亚马来虎（Panthera tigris jacksoni）的猎物偏好对于指导保护规划举措非常重要。DNA的利用提供了有价值的见解，特别是在食肉动物饮食研究领域。这项技术已被证明对识别粪便等复杂混合物中的各种物种是有效的，因为视觉识别具有挑战性。细胞色素c氧化酶亚基I（COI）基因座已被选择，因为它被广泛用作饮食研究的有效非侵入性方法。因此，鉴于这种先进的方法，马来亚虎粪便是根据它们在两种栖息地的现有记录收集的，即保护区（PA）和人虎冲突（HTC）地区。本研究旨在利用DNA技术，基于马来虎粪便样本，识别马来西亚半岛的猎物物种。基于部分线粒体，导致了粪便中猎物DNA残留的分类学解析，并鉴定了马来虎消耗的猎物物种，这些猎物主要是中小型猎物，包括牲畜。检测到的主要DNA猎物属于犬科，其次是牛科、蝙蝠科、人类、猫科、雉科和鼠科。在两个不同的栖息地组，即PA和HTC，使用香农指数（PS，香农多样性指数是一种基于信息理论的测量指数，在生态学中应用很广泛。）和置换多元方差分析(PERMANOVA)观察到α和β多样性在猎物丰富度和均匀度方面存在显著差异（p<0.05）。我们的发现为马来虎的饮食需求提供了见解，可用于制定马来虎的保护计划和策略，特别是栖息地优先事项。

马来虎（Panthera tigris jacksoni）是一种著名的顶级捕食者，在马来西亚受到了相当大的关注。马来西亚半岛约占马来西亚陆地面积的6%，被指定为完全保护区，包括由野生动物和国家公园部（PERHILITAN）管理的国家公园和野生动物保护区，以及受州政府监督的州立公园（Kawanishi et al. 2010）。根据Kawanishi（2010）的研究，马来西亚51%的土地被确定为潜在的老虎栖息地，其中包括29%的确认老虎栖息地、9%的预期老虎栖息地和13%的可能老虎栖息地。近年来，老虎的潜在和预期栖息地有所减少。马来虎需要大型猎物和广阔的栖息地才能生存。然而，持续的人为活动，如非法狩猎、工业和农业扩张以及人类住区的建立，导致了栖息地的破碎化和退化，从而导致马来西亚的老虎数量大幅下降（Topani 1990; Elagupillay et al. 2001; Kawanishi et al. 2006; Shevade et al. 2017; Ten et al. 2021）。目前，野生栖息地中仅存不到200只马来虎（Halim et al. 2019）。导致马来虎数量下降的其他因素包括马来虎栖息地猎物物种的持续枯竭，这被认为是目前对老虎的主要威胁。猎物物种的可用性将决定马来虎的行为、健康、社会结构和生存。老虎可以生活在一个多样化的栖息地和环境中，在这种环境中，它们可以吃掉不同大小的猎物，它们的狩猎策略会根据栖息地、猎物类型和猎物大小而变化（Karanth 2003）。
捕食者在塑造生态系统内食物网的结构方面发挥着至关重要的作用（Ritchie et al. 2012）。猎物的选择可以改变群落的组成和功能，捕食者与猎物的关系可以影响栖息地的结构、种群的行为及其存活率。栖息地的丧失和破碎化也会影响捕食者与其猎物之间的关系（Haapakoski et al. 2013）。此外，栖息地退化极大地影响了需要大栖息地的大型捕食者。大型捕食者（如大型猫科动物）的社会结构取决于猎物生物量的可用性（Simcharoen et al. 2014），野生猎物的可用性表明了它们生长、生存和繁殖的资源。猎物的选择决定了它们的饮食习惯，而饮食习惯又决定了它们生存的策略，包括运动、栖息地选择、社会结构、地理分布和繁殖成功率（Sunquist and Sunquist 1989）。然而，关于马来西亚半岛马来虎实时选择猎物的信息尚不清楚。

确定马来亚虎的实时猎物选择对于认识到这种濒危物种未来的基本保护需求是必要的。捕食者的猎物选择研究已经以不同的方式进行，例如通过使用微观形态分析（Reddy et al. 2004; Ramesh et al. 2009; Kumar 2015; Upadhyaya et al. 2018; Matthews et al. 2020）和分子DNA方法（Xiong et al. 2017; Thuo et al. 2019; Hacker et al. 2021; Lu et al. 2021），通过粪便中未消化的猎物残骸，如毛发、皮毛、骨骼和指甲，进行直接观察和粪便分析。直接观察马来虎的觅食行为具有挑战性，因为它们的栖息地难以捉摸，在野生栖息地（如觅食区）的可达性有限，耗时且种群密度低。这个物种也被认为是危险的。同时，微观形态粪便分析面临着同域分析的错误识别（Monterroso et al. 2018），并且很难获得准确的猎物列表，特别是对于粪便中没有硬质成分的物种的密切相关的猎物分类群（Da Silva et al. 2019）。
这两种方法在我们的研究中都有局限性，例如直接观察期间的安全性，以及缺乏关于毛发、皮毛和其他野生动物部分的参考库数据库。该数据库仍有待国家野生动物法医实验室（PERHILITAN）的法医形态学团队开发。除了对未消化的猎物进行粪便分析以检测老虎的饮食外，利用DNA进行高通量下一代测序（NGS）的分子遗传学最新进展在确定当前马来亚虎猎物选择方面显示出巨大的应用潜力。目前，粪便中猎物的分子鉴定被用来补充形态分析。近年来，DNA已被广泛用于确定各种动物类群的饮食。从粪便中检测猎物的分子方法是一种时间和成本效益高的工具（Mumma et al. 2015），它可以解决通过传统方法检测捕食者消耗的猎物物种的困难，例如直接观察进食行为和通过微观分析。

马来西亚使用DNA进行粪便分析的研究趋势已针对各种物种，如灵长类动物、大象、蝙蝠、鸟类和昆虫（Aziz et al. 2017; Chan et al. 2020; Osman et al. 2020, 2022; Fahimee et al. 2021; Abdullah-Fauzi et al. 2022; Mansor et al. 2022; Mohd-Radzi et al. 2022）。然而，缺乏使用DNA方法对野生大型猫科动物进行的研究，特别侧重于鉴定马来亚虎的肠道微生物组组成（Khairulmunir et al. 2023）。考虑到该物种很难采用替代饮食方法，DNA为确定马来西亚半岛马来虎目前的猎物偏好提供了机会。本研究通过靶向部分COI区域使用DNA元条形码来确定马来虎在自然栖息地的猎物偏好。在之前的研究中，COI已被用于识别各种物种的猎物选择，如雪豹、灵长类动物、大水獭、海狮、蝙蝠、鸟类和小林姬鼠（Srivathsan et al. 2016; Berry et al. 2017; Bohmann et al. 2018; Rytkönen et al. 2018; Hacker et al. 2021; Quéméré et al. 2021; Tercel et al. 2021; Sato et al. 2022），因为它具有高分辨率的物种识别和保守基因。因此，我们的研究旨在使用COI检测马来虎粪便中的猎物。众所周知，老虎有不同的栖息地偏好。在马来西亚，老虎在从山区到低地森林的各种森林植被类型中活动。老虎可能出现在森林边缘附近，这些边缘通常与人类定居点相邻。这些地区可以提供自然栖息地和人类改造景观的混合体，如油棕树种植园。偶尔，老虎可能会冒险进入人类定居点，导致冲突，因为它们可能会捕食牲畜或与人类接触。本研究根据收集的样本将栖息地偏好分为两组：保护区（PA）和人类居住区附近的森林边缘（人虎冲突，HTC）。因此，这项研究可以深入了解它们在两个不同栖息地的当前饮食，这些信息可以用来强调有效的老虎保护规划策略的重要性。
2021年至2022年间，从已知有马来亚虎居住的地区共收集了33个粪便样本。图1显示了马来西亚半岛三个州的采样位置。采样是通过在保护区（PA）和人类居住区附近的森林边缘（HTC）徒步旅行和巡逻进行的。在粪便样本采集过程中，粪便的现场识别是基于大小和形状的；然而，这种策略有时是不一致和不可靠的，因为食肉动物的体型在物种和年龄组内可能会有很大差异。在森林中寻找马来虎粪便的困难可能是由于该地区老虎数量的减少或森林的破碎化，这也限制了它们的活动。在野外采样期间，收集了所有相关数据，包括其他动物物种的存在及其痕迹，以确定马来亚虎在特定研究区域的潜在猎物选择。收集了在森林地面徒步和搜索过程中发现的所有潜在猫科动物粪便，无论它们被认为有多大。根据对粪便大小和形状的观察，老虎的粪便直径大多在2.5厘米以上，豹的粪便直径则在2.5厘米以下。此外，还从因HTC而被捕或获救的马来虎身上获得了粪便。在现场采样期间，将粪便样本保存在冰箱中，并在DNA提取前保存在-80°C。
在野外采样期间收集的33个猫科动物粪便中，只有13个被确认为马来虎。然而，由于DNA浓度低，马来亚虎粪便中只有10 gDNA产物被进行了NGS分析。在Illumina Miseq平台上进行DNA分析，过滤后共生成2132729个原始读数。然后，去除低质量序列、引物接头和嵌合读数，保留440272个读数。剩余的COI数据与NCBI核苷酸数据库进行了比对。13885读数的稀疏曲线（图2）表明，样本达到渐近线，采样深度足以估计多样性。表2显示了在过滤和稀疏过程中生成的读取计数摘要。

马来虎是一种顶级捕食者，在马来西亚的生态系统中起着至关重要的作用。老虎栖息地中猎物物种的丰度和出现与捕食者-猎物的相互作用有关，包括生存、行为及其运动区域。本研究在马来虎的野生栖息地进行了粪便样本采集，以了解马来虎在马来西亚半岛对猎物的选择。图7显示了通过线粒体DNA（mtDNA）D-loop区的分子检测鉴定出的10个确认来自马来虎的粪便样本。本研究中的分类学分类分析表明，在10个粪便样本中，只有3.56%的脊索动物门COI序列被生成。本研究中产生的大多数序列主要是真菌、领鞭毛虫、变形虫、盘嵴亚界、绿色植物、其他后生动物和未知真核生物的COI序列（94.02%）。另有2.42%的COI序列无法归属于任何分类组（未知/未分类序列）。这可能是由于样本质量和引物敏感性检测马来亚虎粪便中的DNA猎物。
本研究发现，马来西亚半岛选定地区的马来虎粪便组成以中等猎物（67.9%）、牲畜（20.8%）和小猎物（5.7%，图5A）为主。根据我们的发现，与保护区（PA）相比，缓冲区（HTC）的马来虎猎物有所不同。在保护区，马来亚虎的猎物选择包括狗、蝙蝠、鬣羚、啮齿动物和有鳞目。同时，在缓冲区发现的主要猎物DNA包括来自牲畜物种（牛、水牛、山羊、鸡）、啮齿动物、人类和猫的猎物分类群。α（香农指数）和β多样性（PERMANOVA）分析显示，保护区（PA）组和缓冲区（HTC）组之间存在显著差异（p<0.05）。这一发现可能是由于栖息地特征，这些特征会影响每个栖息地组中猎物可用性的选择。因此，保护区（PA）组和缓冲区（HTC）组之间的显著差异也是由于缓冲区（HTC）组中老虎粪便中发现的猎物成分的差异，即牲畜，以及缓冲区（HTC）组中人类DNA的检测。如图5所示，在HTC组中检测到牲畜和人类DNA；同时，在保护区（PA）组中没有发现这些猎物类群。此外，在从缓冲区（HTC）组收集的马来亚虎粪便样本中发现了人类DNA。这一发现归因于两个粪便样本，这些样本来自之前参与人类袭击的老虎。行为和栖息地结构对食物需求的变化使马来虎与人类和牲畜发生冲突。野生动物和国家公园部（2008年）报告称，马来亚虎也在老虎栖息地附近狩猎牲畜。最近，马来亚虎被发现更靠近人类居住区和油棕种植园，因为那里有牲畜，它们可以很容易地狩猎和捕食牲畜。老虎狩猎牲畜的发生可归因于马来亚老虎向有牲畜的地区迁徙，以及它们无法在其原生栖息地内满足基本的饮食需求（Kumar 2015）。因此，老虎会从森林地区转移到缓冲区，因为当它们发现更多的牲畜可以接近并且容易捕食时，它们会被迫这样做（Kolipaka et al. 2017）。

对栖息在保护区（PA）的马来亚虎的粪便成分分析检测到HSKP-21-13样本中存在狗的DNA，PSC12和PSC13的血清DNA；同时，在名为PSC12的粪便样本中发现了蝙蝠、啮齿动物和有鳞目的DNA。值得注意的是，本研究中的COI分类分析没有发现之前研究（Lynam et al. 2007; Kawanishi et al. 2010）中报告的马来虎的任何常见猎物，如野猪、赤麂和水鹿。在保护区（PA）组的马来虎粪便样本中没有发现大型猎物物种。在森林地区，大型猎物可能很少；因此，狩猎大型猎物也很少。因此，当主要猎物稀缺时，老虎会改变饮食。这一因素可以解释为什么老虎更喜欢非选择性地捕食中小型物种。我们假设马来西亚半岛的马来虎有更广泛的猎物大小来满足它们的饮食需求。以前的研究很少报道老虎捕食的小型猎物。然而，根据Schaller（1967）的一项研究，孟加拉虎除了大量食用白斑鹿、野猪、恒河猴和泽巨蜥外，还捕食较小的物种，如灵猫、泽巨蜥、鸟类、鱼类和青蛙。这一发现与我们的研究相一致，表明不同亚种的老虎可以捕食较小的动物，无论使用何种分析方法。在标记为PSC12的粪便样本中发现了蝙蝠。在分析马来虎粪便时检测到这些蝙蝠物种的可能解释是PSC12位置报告的大量蝙蝠种群（Pounsin et al. 2018; Azmir et al. 2022）。该地区由丘陵龙脑香林和附近的喀斯特洞穴组成。收集到的粪便样本附近的岩溶洞穴表明，马来亚虎有可能在栖息地捕食蝙蝠。根据PERHILITAN协调的国家老虎调查（NTS）计划，马来亚虎通过相机陷阱在洞穴地区漫游（Halim et al. 2019）。因此，老虎的猎物偏好可能因地点而异。另一种可能性是，马来虎在捕食另一只猎物时间接摄入了这种小型动物。
除上述情况外，在野外采样期间，发现保护区（PA）和缓冲区（HTC）地区有野猪；然而，在我们的分析中，没有在老虎粪便中检测到野猪DNA。Kawanishi（2003）认为，野猪的丰富性和几乎所有植被（包括油棕种植园）的普遍存在可能是马来虎的主要猎物，尽管一些鹿的种群已经枯竭。然而，老虎更喜欢捕食牲畜和中小型物种，以满足保护区（PA）和缓冲区（HTC）的食物饮食需求。在这项研究中，老虎更喜欢牲畜、小型和其他中型物种而不是野猪的原因尚不清楚。因此，调查这一说法以及牲畜在多大程度上增加了老虎的饮食，对于了解老虎栖息地超出自然可用范围的实际生产力非常重要（Kawanishi et al. 2003）。如前所述，老虎猎物可能因地点而异；然而，一般来说，野猪和水鹿是与老虎作为猎物有关的最重要的植食性哺乳动物（Reddy et al. 2004; Ramesh et al. 2009; Mukherjee and Sarkar 2013; Kumar 2015; Upadhyaya et al. 2018）。

根据这项研究的结果，马来虎粪便中的猎物DNA可能受到其他因素的影响，如粪便样本质量、捕食时间和所用基因的选择。DNA猎物的检测取决于几个因素，特别是马来虎吃掉猎物物种的时间。由于长期暴露在环境中，一些DNA被降解，粪便样本的新鲜度影响了猎物物种的检测和鉴定（Upadhyaya et al. 2018）。Thuo（2019）对各种因素对猎物DNA检测的影响进行了研究，如猎物进食时间（进食日）、粪便年龄、猎物种类和食量。研究表明，猎物DNA检测在猎物被吃掉的第0天较弱。然而，DNA在第1天很高，然后在第二天下降。此外，根据猎物种类，与鹌鹑和兔子相比，鸡、鹿和马在食用当天更容易被发现。此外，对粪便中猎物物种识别的评估受到猎物大小的影响。根据Ackerman（1984）的研究，小型猎物每单位体重有大量的毛发，这导致它们的粪便中发现了未消化的毛发。粪便中大量毛发的存在可能会导致对食肉动物饮食中较小猎物物种出现的夸大观察。这项研究表明，每个粪便中猎物物种的出现频率较低。有几个因素会影响这种频率，包括：1）样本量，2）样本质量或3）捕食时间（猎物物种是最近被猎杀还是被猎杀了很长时间）。因此，本研究建议未来的研究通过进行更长时间的现场采样和覆盖更广泛的研究区域来增加样本数量。
影响结果的另一个因素是粪便样本中猎物DNA检测的基因或引物的选择。在这项研究中，分类学分类分析表明，2.42%的COI序列无法归属于任何分类组（未知/未分类序列）。部分COI基因（mlCOIntF和dgHCO2198R）在所有样本中只能识别3.56%的脊索动物分类群，另外94.02%的序列在很大程度上识别了其他真核生物，如真菌、变形虫、病毒双链体和除脊索动物以外的另一种后生动物。本研究中使用的COI部分区域是COI条形码引物的分类覆盖不足。Hacker（2021）利用雪豹的COI区域进行了一项研究，分析了MT-COI并识别了猎物，特别是雪豹粪便中的羊亚科。然而，他们发现只有山羊和绵羊的DNA被成功扩增，而其他有蹄类动物科或哺乳动物目的DNA没有被检测到。DNA有其自身的不足，它取决于DNA参考数据库的准确性和覆盖范围（Nielsen et al. 2018; Traugott et al. 2020）。COI引物可用于从无脊椎动物中识别猎物物种，但对脊椎动物猎物物种的识别作用不大。此外，使用一组专注于特定猎物群体的引物可能会产生有偏见的结果（Da Silva et al. 2019）。根据Quéméré（2021）的研究，使用多个引物可以产生更全面的结果。使用多个标记可以提高识别单个分类群的精度，并有助于提高饮食概况的整体精度（Ando et al. 2020）。因此，本研究建议，未来的研究应考虑纳入多个位点或其他替代位点，以调查马来西亚半岛马来虎难以捉摸的猎物选择。

本研究首次通过粪便的DNA来调查和描述马来亚虎的猎物选择。尽管本研究分析的粪便数量相对较少，但结果表明了马来西亚半岛马来虎猎物选择的现状。在保护区（PA）和缓冲区（HTC），马来虎主要食用牲畜和中小型猎物。人类的扩张可能是猎物选择向牲畜和中小型猎物物种转变的主要原因。马来虎的猎物选择受到人类对环境的改变的影响。森林破碎化导致马来虎的活动区向人类区移动，特别是油棕种植区和人类定居点。通常，当地人拥有的牲畜通常被放置在他们的油棕种植区内，马来西亚半岛的大多数油棕种植园都靠近森林，使该地区成为缓冲区（HTC）。当牲畜可用时，老虎会很容易地捕食它们。根据我们的研究结果，未来对老虎饮食的研究应考虑使用多位点DNA并进行更长时间的现场采样，并应覆盖更广泛的领域，以了解老虎饮食的时空变化。这种方法将为研究它们在野外的偏好提供其他机会。尽管这项研究不能用于量化猎物物种的真实丰度或比例，但它为识别马来亚虎饮食中的猎物分类群和时空模式迈出了重要的第一步。与大型猎物相比，人们对中小型猎物的关注较少，导致对其生态作用的认识不足。应考虑这一限制，以帮助规划马来西亚半岛马来虎的保护策略。本研究获得的数据将改善饮食的了解，可用于制定马来亚虎的保护计划和战略，特别是在特定地区的栖息地优先事项、保护和恢复方面。

个人分析和总结：
1.野生猎物的可用性表明了它们生长、生存和繁殖的资源。猎物的选择决定了它们的饮食习惯，而饮食习惯又决定了它们生存的策略，包括运动、栖息地选择、社会结构、地理分布和繁殖成功率；
2.马来虎是一种顶级捕食者，在马来西亚的生态系统中起着至关重要的作用；
3.马来西亚半岛选定地区的马来虎粪便组成以中等猎物（67.9%）、牲畜（20.8%）和小猎物（5.7%）；
4.在保护区马来亚虎的猎物选择包括狗、蝙蝠、鬣羚、啮齿动物和有鳞目（蜥蜴）；
5.在缓冲区发现马来虎主要猎物牲畜物种（牛、水牛、山羊、鸡）、啮齿动物、人类和家猫；
6.在森林地区，大型猎物可能很少，因此，当主要猎物稀缺时，老虎会改变饮食。马来虎的体型也有资本灵活的改变饮食；
6.这一因素可以解释为什么老虎更喜欢非选择性地捕食中小型物种。我们假设马来西亚半岛的马来虎有更广泛的猎物大小来满足它们的饮食需求。以前的研究很少报道老虎捕食的小型猎物；
7.本研究中没有发现之前研究中报告的马来虎的任何常见猎物，如野猪、赤麂和水鹿。在保护区（PA）组的马来虎粪便样本中没有发现大型猎物物种；
8.马来亚虎也在老虎栖息地附近狩猎牲畜。老虎狩猎牲畜的发生可归因于马来亚老虎向有牲畜的地区迁徙，以及它们无法在其原生栖息地内满足基本的饮食需求。因此，老虎会从森林地区转移到缓冲区，因为当它们发现更多的牲畜可以接近并且容易捕食时，它们会被迫这样做；
9.在缓冲区收集的马来亚虎粪便样本中发现了人类DNA。这一发现归因于两个粪便样本，这些样本来自之前参与人类袭击的老虎；
10.孟加拉虎除了大量食用白斑鹿、野猪、恒河猴和泽巨蜥外，还捕食较小的物种，如灵猫、泽巨蜥、鸟类、鱼类和青蛙；
11.该地区由丘陵龙脑香林和附近的喀斯特洞穴组成。收集到的粪便样本附近的岩溶洞穴表明，马来亚虎有可能在栖息地捕食蝙蝠，另一种可能性是，马来虎在捕食另一只猎物时间接摄入了这种小型动物；
12.在野外采样期间，发现保护区（PA）和缓冲区（HTC）地区有野猪；然而在本次研究中没有马来虎捕食野猪的证据。

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