大家好，今天跟大家分享这篇题为Tumor-resident Lactob acillus iners confer chemora diation resistance through lactate-induced metabolic rewiring（肿瘤驻留乳杆菌通过乳酸诱导的代谢重连赋予化疗耐药性）肿瘤，即使在所谓的无菌器官中，也具有独特的微生物群，可以改变治疗反应和生存。
01
研究背景
肿瘤微生物群可以产生影响癌症和免疫细胞信号传导、代谢和增殖的活性代谢物。在这里，我们使用深层微生物组测序、靶向细菌培养和体外测定的组合方法探索影响宫颈癌患者放化疗反应的肿瘤和肠道微生物组特征。
我们发现，在肿瘤中发现的一种产生专性L-乳酸的乳酸菌，乳酸菌，与患者生存率降低有关，诱导宫颈癌细胞的化疗和放疗耐药性，并导致肿瘤中的代谢重新布线或多种代谢途径的改变。
与身体其他部位共生的产生 L-乳酸的基因组相似的乳酸菌也与结直肠癌、肺癌、头颈癌和皮肤癌的存活率显着相关。我们的研究结果表明，肿瘤微环境中的乳酸菌可以改变肿瘤代谢和乳酸信号通路，导致治疗耐药性。乳酸菌可能是各种癌症类型的有前途的治疗靶点。
见图一
肿瘤驻留的L. iners与宫颈癌患者的无复发期和总生存期降低有关。
图一
（A） 研究患者的研究设计和标准护理治疗算法，在每个时间点收集的宫颈肿瘤拭子数量用于 16S 核糖体 RNA 测序 （16S）。患者接受 5 周的 EBRT 联合顺铂治疗，然后在 3 个月时接受近距离放射治疗和重复影像学检查以缓解疾病反应。取样在基线、放疗第 1、3 和 5 周以及随访 3 个月时进行。
（B） 在基线（预处理）时收集并可用于每次分析的样品类型。在可能的情况下，在每个时间点从每位患者那里收集肿瘤和肠道样本;然而，并非所有样本在每个时间点都收集或可用于测序。
（C） 对来自宫颈肿瘤拭子的 16S 数据进行线性判别分析效应大小 （LEfSe） 分析，以分析在试点队列 （N = 41） 中富含对辐射无反应的细菌。LEfSe 分析使用默认参数，LDA 阈值为 4.0，用于统计显着性和可视化。
（D） 基线时所有患者宫颈肿瘤拭子的 16S 组成堆积条形图 （N = 97），按阴道群落状态类型 （CST） 排序，包括 L. iners（红色）、G. vaginalis（蓝色）和 P. bivia（绿色）。
（E） Kaplan-Meier 无复发生存期 （RFS） 曲线按肿瘤 L. iners 的存在 （N = 44） 或不存在 （n = 52） 分层。生存曲线在 24 个月时被删失。用于比较的日志排名测试。事件总数 # = 33。
（F） CRT 期间收集的宫颈肿瘤拭子中 L. iners 的 16S 相对计数。第 1 周 （N = 68）、第 3 周 （N = 66）、第 5 周 （N = 78） 和随访 （N = 30） 与基线 （N = 96） 相比，使用配对 t 检验和错误发现率 （FDR） 调整后的 p 值。方框表示四分位距（第 25 位到第 75 位），条形表示中位数，晶须表示最小值和最大值。
（G） 总生存期 （OS） 的多变量 Cox 比例风险分析，调整肠道微生物组多样性 （N = 90） 和肿瘤 L. iners （N = 90）。事件总数 # = 14。正方形表示风险比 （HR），条形表示 HR 的 95% 置信区间。
（H） 按肿瘤大小分层的 L. iners 的基线相对计数（FIGO 2009 I-II 期 [N = 54] 与 III-IV 期 [N = 47]）。未配对 t 检验。NS = p > 0.05。方框表示四分位距（第 25 位到第 75 位），条形表示中位数，晶须表示最小值和最大值。
（I） FIGO 2009 I-II 期肿瘤患者的 Kaplan-Meier RFS 曲线，按肿瘤 L. iners 的存在 （N = 26） 或不存在 （n = 26） 进行分层。生存曲线在 54 个月时被删失。用于比较的日志排名测试。
见图二
L. iners在体外诱导治疗耐药性。
图二
（A） 建立和维持患者来源的类器官 （PDO） 和 B188 原代细胞的工作流程。
（B） 用抗 P63 和抗 Ki67 抗体对 PDO B1188 进行阳性染色，同时抗 CK13 抗体和 PAS 的分化标志物染色表达降低，确认鳞状癌来源。抗 panCK 标志物的阳性染色表明原发性癌细胞起源。比例尺，100μm。
（C） 用癌症来源的 L. iners （CC-L. iners） 无细胞上清液 （CFS） 与对照 （NYC Broth） 预处理的 PDO B1188 的明亮视图，然后进行 4 Gy 照射。比例尺，1 毫米。
（D） 用 CC-L. iners CFS（红色）与非癌症来源的 L. iners CFS（红色）与对照（NYC Broth;灰色）预处理的 PDO B1188 类器官的类器官大小和计数（占总数的百分比）的直方图，然后进行 4 Gy 照射。
（E） 用 CC-L. iners 游离上清液 （CFS） 与对照 （NYC Broth） 预处理的 PDO B1188 辐照类器官的细胞活力（通过 CellTiter Glo 测量），然后进行 4 和 8 Gy 辐照。2 次实验，3 次重复。单因素方差分析（CFS 与对照）。
（F） 辐照后的 B1188 细胞活力。
（G） 辐照后的HeLa细胞活力。
（H） 辐照后的SiHa细胞活力。
（I）辐照后的CaSki细胞活力。
（J） 吉西他滨 （GEM） 处理后的 B1188 细胞活力。
（K） 顺铂 （CIS） 和 2 Gy 照射后的 B1188 细胞活力。
（L） 5-氟尿嘧啶 （5-FU） 后的 B1188 细胞活力。
（M） GEM 和 2 Gy 辐照后的 B1188 细胞活力。
（N） CIS + 2 Gy 辐照后的 B1188 细胞活力。
（O） = 5-FU 和 2 Gy 后的 B1188 细胞活力
（P） B1188 细胞活力与紫外线杀灭的细菌片段和 IR。1 次实验，3 次重复。用对照（NYC Broth）、NC-L. iners CFS 或 CC-L. iners CFS （F–O） 对细胞进行预处理后的细胞活力（通过 CellTiter Glo 测量）;3 个实验，每个实验 3 次重复 （F–O）;2 患者来源的 CC-L。合并的iners菌株（E-P）;CC-L之间的单向方差分析。给出了平均值和 SEM 的 iners（E-P）。
见图三
L. iners 通过增加肿瘤微环境中的 L-乳酸产生引起治疗耐药性。
图三
（A） 肿瘤微环境中 L-乳酸乳杆菌产生的假设示意图“启动”宫颈癌细胞的乳酸成瘾，通过上调 GLUT1、MCT1 和 MCT4 驱动乳酸利用的反馈回路，以及乳酸调节的活性氧信号传导、HIF-1、NFkB、FGFR、ErbB3/HER 2/3 和 p53 依赖性途径。
（B） 在 RNA 测序之前用 L. iners（1 个 NC-L. iners 菌株，2 个 CC-L. iners 菌株）与对照（NYC 肉汤）CFS 预处理的 B1188 细胞。图中显示了从对照组（右）到L. iners（左）的基因表达的倍数变化。Log2（倍数变化）阈值为 −1、1。–Log10（FDR 调整的 p 值）阈值为 1.2。
（C）显著改变基因的元核心通路分析。前 5 个最显着改变的通路按 -Log10（FDR 调整的 p 值）排名。条形上方的数字表示每个通路中改变的基因比例。
（D） 癌症来源的 CC-L. crispatus、CC-L. iners、NC-L. crispatus、NC-L. iners 和对照（纽约肉汤）细菌培养物中 L-乳酸的产生。
（E） 癌症来源的 CC-L. crispatus、CC-L. iners、NC-L. crispatus、NC-L. iners 和对照（NYC 肉汤）细菌培养物中 D-乳酸的产生。
（F） 用于对照的细菌培养物（NYC Broth）、NC-L. iners 或 CC-L. iners 中的 L-乳酸水平。
（G） 宫颈肿瘤 Cytobrush 样品的 L-乳酸和 D-乳酸相对水平 （g/L）（对数刻度）。N = 29。
（H）代谢物的主成分分析（PCA）。
（I）差异丰度最高的代谢物的无监督分层聚类，按代谢过程分组。
（J） 辐照 （4 Gy） 后用 20 mM 乳酸亚型（L-乳酸、D-乳酸、L-乳酸钠、D-乳酸钠、培养基对照）预处理的 B1188 细胞的细胞活力 （CellTiter Glo）。
（K） GEM 后用 20 mM 乳酸亚型预处理的 B1188 细胞的细胞活力 （CellTiter Glo）。
（L） L. iners+ 患者在 EBRT 之前、期间（第 1 周、第 3 周）和之后（第 5 周）宫颈肿瘤 Cytobrush 样本中的 L-乳酸水平 （BL N = 1;周1 N = 6;Wk3 N = 2;Wk5 N = 4） 和 L. iners– 患者 （BL N = 3;周1 N = 4;Wk3 N = 6;Wk 5 N = 4）。
（M） 宫颈肿瘤 Cytobrush 样本中的 D-乳酸水平。
（N） 用于培养基对照的 L-乳酸水平 （−/−），单独培养的 L. iners （+/−），单独培养的 B1188 细胞 （-/+），与用 L. iners CFS （+/+） 处理的 N. iners 处理的 B1188 细胞用于 NC-L. iners 和 CC-L. iners。
（O） 用 NYC 肉汤（对照）、NC-L. iners （N = 1） CFS 和 CC-L. iners （N = 2） CFS 处理的原代细胞 B1188 中存在的差异丰度代谢物，未经辐照 （0 Gy） 或辐照 （8 Gy），按代谢过程分组。差异丰度最高的代谢物的无监督分层聚类，按代谢过程（I，O）分组;通过 Megazyme 试剂盒 （D， E）、TC-MS （L–N） 或 HR-MS/IC-MS （I， O） 进行分析;Wilcoxon 秩和检验 （J–M）、具有均值和 SEM （G） 的未配对 t 检验或 NS p > 0.05 的双向方差分析 （F），∗p ≤ 0.05，∗∗p ≤ 0.01，∗∗∗p ≤ 0.001，∗∗∗∗p ≤ 0.0001;1 个 （B， F， J），N，2 （H–J） 或 3 （K） 个实验，每个实验重复 3 次，2 个 CC-L。合并的iners菌株（B，F，J）;1 个实验，1 个培养板，无统计比较 （D， E）。Wilcoxon 秩和检验与未调整 （J–L） 和调整 （N） 的 CTRL 相比;用 MRS 肉汤（L. crispatus 对照）、NYC Broth（L. iners 对照）以及癌症和非癌症来源的 L. iners （N = 3） 和 L. crispatus 菌株 （N = 2） （H， I） 处理的细胞的比较。归一化为未辐照介质对照 （J， K）。
见图四
与 L. iners 阴性肿瘤相比，L. iners 阳性肿瘤具有代谢改变。
图四
（A） 肿瘤代谢物相对丰度的主坐标分析 L. iners+ （N = 36） 和 L. iners– 肿瘤 （N = 30）。色散可分离性准则，p < 0.005。
（B）不同丰度代谢物的火山图。–Log10（调整后的 p 值）阈值 = 1.0;log2（倍数变化）阈值 −1 到 1。
（C）不同丰度代谢物的监督分层聚类。
（D）差异富集代谢物通路分配的棒棒糖图。按 log10 量表上的效应大小排序。∗FDR-adj p < 0.05。
通过 HR-MS 和 IC-MS （A–D） 进行分析。
见图五
癌症来源的 L. iners 获得比 NC-L. iners 产生乳酸的额外基因，并改变与内在辐射敏感性相关的通路中的癌细胞基因表达。
图五
（A） CC-L. iners （16%） vs. NC-L. iners （2%） vs. 共享 （81%） 的比较基因组分析中的重叠和独特基因。
（B） 健康 L. iners 与发育不良 L. iners 与 CC-L. iners 的比较基因组分析中的重叠基因。
（C）在比较基因组分析中，CC-L.iners和CC-L.iners（黑色）共有通路中的序贯基因以及CC-L.iners（红色）特有的基因。CC-L. iners 中的 LacG 编码可逆酶 6-磷酸-β-半乳糖苷酶，该酶将乳糖转化为半乳糖，而 CC-L. iners ers 仅利用 lacDRA 通路中的乳糖。LacR 是一种阻遏物开关，用于关闭乳糖代谢以泌乳。
（D） 富含 CC-L. iners 分离株与 NC-L. iners 分离株的代谢物通路分配的棒棒糖图。半乳糖代谢是唯一上调的途径，与 lacG 基因获取和 6-磷酸-β-半乳糖苷酶活性一致。∗FDR-adj p < 0.05。
（E） B1188 细胞的前 7 个差异表达的元核心通路。条形上方的数字表示每个通路的基因发生了显着改变。
（F） B1188 细胞的前 7 个差异表达元核心过程。条形上方的数字表示每个通路的基因发生了显着改变。
（G） 辐照 （8 Gy） 30 小时后预处理的 B1188 细胞的 Gamma H2AX 和 DAPI 荧光染色。比例尺，100 μm。
（H） 在每种 CFS 条件下用 8 Gy 处理的原代细胞 B1188 的 Gamma H2AX 动力学。
（I） 预处理的 B1188 原代细胞的抗放射性 EdU DNA 合成测定。归一化为 0 Gy（黑色）。
Log2（倍数变化）截止值为 2.0 （E， F）;1 个独立实验，1 个 （I） 或 3 个 （E） 重复，2 个 CC-L. iners 菌株合并 （E） 或单独 （I）;没有进行统计比较（H，I）。
见图六
L. iners 和基因组相似的共生产 L-乳酸细菌 （LAB） 预示着不同癌症类型的预后不良。
图六
（A） 来自非小细胞肺癌 （NSCLC） TCGA 数据集的原发性肿瘤样本中存在 （N = 57） 或不存在 （N = 990） 的无复发生存期 （RFS）。用于比较的对数秩测试。
（B） 在比较基因组分析中发现的连续操纵子，在 L. iners 分离株和沉积基因组 （CC-L. iners = 2， NC-L. iners = 2） 中发现的连续操纵子。橙色表示仅在 CC-L. iners 分离株中发现的 lacG 基因，而红色表示在所有 L. iners 分离株中发现的 lac 基因。
（C） 在TCGA数据集中鉴定遗传相似的LAB物种的流程图。
（D） 在 MDACC（肛门、阴道/外阴、子宫颈）和 TCGA 数据集（头颈部、皮肤、结直肠、肺）中基因组上与 L. iners 基因组相似的 lacGDRA 细菌的频率 （N = 46）。红框表示物种存在，并与单个数据集中的 RFS 和/或总生存期 （OS） 降低相关。蓝色框表示物种存在于数据集中，但与 RFS 或 OS 无关。
（E） 来自细菌和病毒生物信息学资源中心 （BV-BRC） 的 NSCLC 患者的 RFS，按存在 （N = 262） 或不存在 （N = 576） 的任何 lacGDRA 物种分层。用于比较的对数秩测试。
（F） 结直肠腺癌患者的 RFS，按存在 （N = 155） 或不存在 （N = 276） 任何 lacGDRA 物种进行分层。用于比较的对数秩测试。
（G） 头颈部鳞状细胞癌 （HNSCC） 患者的 RFS，按任何 lacGDRA 物种的存在 （N = 31） 或不存在 （N = 91） 进行分层。用于比较的对数秩测试。
（H） HNSCC 患者的 RFS 分层，根据存在至少一种产专性 D-乳酸的 lacGDRA 细菌物种（Leptotrichia trevisanii 或 Leptotrichia wadei）和没有产专性 L-乳酸的 lacGDRA 细菌菌种 （N = 64） 与至少一种产 L-乳酸的菌种（副加醋酸乳杆菌、婴儿链球菌、约翰逊乳杆菌、链球菌属口服分类群 064，或副干酪乳杆菌;N = 15）。用于比较的对数秩测试。
（I） HNSCC 患者的 OS 分层为存在至少一种产专性 D-乳酸的 lacGDRA 细菌物种（Leptotrichia trevisanii 或 Leptotrichia wadei）和没有产专性 L-乳酸的 lacGDRA 细菌菌种 （N = 77） 与至少一种产 L-乳酸的菌种（副加塞氏乳杆菌、婴儿链球菌、约翰逊乳杆菌、链球菌属口服分类群 064，或副干酪乳杆菌;N = 29）。Kaplan-Meier生存曲线与对数秩检验进行比较。（A、E-I）。用于比较的对数秩测试。
02
研究结论
在这里，我们证明了宫颈癌相关的 L. iners，一种产生专性 L-乳酸的兼性厌氧细菌，通过有效的 L-乳酸产生和肿瘤中的代谢重新布线来诱导治疗耐药性。这得到了强大的临床关联、L. iners 或 L-乳酸诱导化疗和放疗耐药性以及其在体外和放疗后在肿瘤中的高乳酸产生的支持。这一发现不仅限于宫颈肿瘤细菌或宫颈肿瘤;相反，我们认为肿瘤相关LAB以与所描述的肿瘤-基质或肿瘤-免疫细胞相互作用类似的方式参与乳酸介导的代谢重新布线，在许多癌症类型中具有广泛的意义。
好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理. 数据分析等支持.也随时可以联系我们。
01
研究背景
肿瘤微生物群可以产生影响癌症和免疫细胞信号传导、代谢和增殖的活性代谢物。在这里，我们使用深层微生物组测序、靶向细菌培养和体外测定的组合方法探索影响宫颈癌患者放化疗反应的肿瘤和肠道微生物组特征。
我们发现，在肿瘤中发现的一种产生专性L-乳酸的乳酸菌，乳酸菌，与患者生存率降低有关，诱导宫颈癌细胞的化疗和放疗耐药性，并导致肿瘤中的代谢重新布线或多种代谢途径的改变。
与身体其他部位共生的产生 L-乳酸的基因组相似的乳酸菌也与结直肠癌、肺癌、头颈癌和皮肤癌的存活率显着相关。我们的研究结果表明，肿瘤微环境中的乳酸菌可以改变肿瘤代谢和乳酸信号通路，导致治疗耐药性。乳酸菌可能是各种癌症类型的有前途的治疗靶点。
见图一
肿瘤驻留的L. iners与宫颈癌患者的无复发期和总生存期降低有关。
图一
（A） 研究患者的研究设计和标准护理治疗算法，在每个时间点收集的宫颈肿瘤拭子数量用于 16S 核糖体 RNA 测序 （16S）。患者接受 5 周的 EBRT 联合顺铂治疗，然后在 3 个月时接受近距离放射治疗和重复影像学检查以缓解疾病反应。取样在基线、放疗第 1、3 和 5 周以及随访 3 个月时进行。
（B） 在基线（预处理）时收集并可用于每次分析的样品类型。在可能的情况下，在每个时间点从每位患者那里收集肿瘤和肠道样本;然而，并非所有样本在每个时间点都收集或可用于测序。
（C） 对来自宫颈肿瘤拭子的 16S 数据进行线性判别分析效应大小 （LEfSe） 分析，以分析在试点队列 （N = 41） 中富含对辐射无反应的细菌。LEfSe 分析使用默认参数，LDA 阈值为 4.0，用于统计显着性和可视化。
（D） 基线时所有患者宫颈肿瘤拭子的 16S 组成堆积条形图 （N = 97），按阴道群落状态类型 （CST） 排序，包括 L. iners（红色）、G. vaginalis（蓝色）和 P. bivia（绿色）。
（E） Kaplan-Meier 无复发生存期 （RFS） 曲线按肿瘤 L. iners 的存在 （N = 44） 或不存在 （n = 52） 分层。生存曲线在 24 个月时被删失。用于比较的日志排名测试。事件总数 # = 33。
（F） CRT 期间收集的宫颈肿瘤拭子中 L. iners 的 16S 相对计数。第 1 周 （N = 68）、第 3 周 （N = 66）、第 5 周 （N = 78） 和随访 （N = 30） 与基线 （N = 96） 相比，使用配对 t 检验和错误发现率 （FDR） 调整后的 p 值。方框表示四分位距（第 25 位到第 75 位），条形表示中位数，晶须表示最小值和最大值。
（G） 总生存期 （OS） 的多变量 Cox 比例风险分析，调整肠道微生物组多样性 （N = 90） 和肿瘤 L. iners （N = 90）。事件总数 # = 14。正方形表示风险比 （HR），条形表示 HR 的 95% 置信区间。
（H） 按肿瘤大小分层的 L. iners 的基线相对计数（FIGO 2009 I-II 期 [N = 54] 与 III-IV 期 [N = 47]）。未配对 t 检验。NS = p > 0.05。方框表示四分位距（第 25 位到第 75 位），条形表示中位数，晶须表示最小值和最大值。
（I） FIGO 2009 I-II 期肿瘤患者的 Kaplan-Meier RFS 曲线，按肿瘤 L. iners 的存在 （N = 26） 或不存在 （n = 26） 进行分层。生存曲线在 54 个月时被删失。用于比较的日志排名测试。
见图二
L. iners在体外诱导治疗耐药性。
图二
（A） 建立和维持患者来源的类器官 （PDO） 和 B188 原代细胞的工作流程。
（B） 用抗 P63 和抗 Ki67 抗体对 PDO B1188 进行阳性染色，同时抗 CK13 抗体和 PAS 的分化标志物染色表达降低，确认鳞状癌来源。抗 panCK 标志物的阳性染色表明原发性癌细胞起源。比例尺，100μm。
（C） 用癌症来源的 L. iners （CC-L. iners） 无细胞上清液 （CFS） 与对照 （NYC Broth） 预处理的 PDO B1188 的明亮视图，然后进行 4 Gy 照射。比例尺，1 毫米。
（D） 用 CC-L. iners CFS（红色）与非癌症来源的 L. iners CFS（红色）与对照（NYC Broth;灰色）预处理的 PDO B1188 类器官的类器官大小和计数（占总数的百分比）的直方图，然后进行 4 Gy 照射。
（E） 用 CC-L. iners 游离上清液 （CFS） 与对照 （NYC Broth） 预处理的 PDO B1188 辐照类器官的细胞活力（通过 CellTiter Glo 测量），然后进行 4 和 8 Gy 辐照。2 次实验，3 次重复。单因素方差分析（CFS 与对照）。
（F） 辐照后的 B1188 细胞活力。
（G） 辐照后的HeLa细胞活力。
（H） 辐照后的SiHa细胞活力。
（I）辐照后的CaSki细胞活力。
（J） 吉西他滨 （GEM） 处理后的 B1188 细胞活力。
（K） 顺铂 （CIS） 和 2 Gy 照射后的 B1188 细胞活力。
（L） 5-氟尿嘧啶 （5-FU） 后的 B1188 细胞活力。
（M） GEM 和 2 Gy 辐照后的 B1188 细胞活力。
（N） CIS + 2 Gy 辐照后的 B1188 细胞活力。
（O） = 5-FU 和 2 Gy 后的 B1188 细胞活力
（P） B1188 细胞活力与紫外线杀灭的细菌片段和 IR。1 次实验，3 次重复。用对照（NYC Broth）、NC-L. iners CFS 或 CC-L. iners CFS （F–O） 对细胞进行预处理后的细胞活力（通过 CellTiter Glo 测量）;3 个实验，每个实验 3 次重复 （F–O）;2 患者来源的 CC-L。合并的iners菌株（E-P）;CC-L之间的单向方差分析。给出了平均值和 SEM 的 iners（E-P）。
见图三
L. iners 通过增加肿瘤微环境中的 L-乳酸产生引起治疗耐药性。
图三
（A） 肿瘤微环境中 L-乳酸乳杆菌产生的假设示意图“启动”宫颈癌细胞的乳酸成瘾，通过上调 GLUT1、MCT1 和 MCT4 驱动乳酸利用的反馈回路，以及乳酸调节的活性氧信号传导、HIF-1、NFkB、FGFR、ErbB3/HER 2/3 和 p53 依赖性途径。
（B） 在 RNA 测序之前用 L. iners（1 个 NC-L. iners 菌株，2 个 CC-L. iners 菌株）与对照（NYC 肉汤）CFS 预处理的 B1188 细胞。图中显示了从对照组（右）到L. iners（左）的基因表达的倍数变化。Log2（倍数变化）阈值为 −1、1。–Log10（FDR 调整的 p 值）阈值为 1.2。
（C）显著改变基因的元核心通路分析。前 5 个最显着改变的通路按 -Log10（FDR 调整的 p 值）排名。条形上方的数字表示每个通路中改变的基因比例。
（D） 癌症来源的 CC-L. crispatus、CC-L. iners、NC-L. crispatus、NC-L. iners 和对照（纽约肉汤）细菌培养物中 L-乳酸的产生。
（E） 癌症来源的 CC-L. crispatus、CC-L. iners、NC-L. crispatus、NC-L. iners 和对照（NYC 肉汤）细菌培养物中 D-乳酸的产生。
（F） 用于对照的细菌培养物（NYC Broth）、NC-L. iners 或 CC-L. iners 中的 L-乳酸水平。
（G） 宫颈肿瘤 Cytobrush 样品的 L-乳酸和 D-乳酸相对水平 （g/L）（对数刻度）。N = 29。
（H）代谢物的主成分分析（PCA）。
（I）差异丰度最高的代谢物的无监督分层聚类，按代谢过程分组。
（J） 辐照 （4 Gy） 后用 20 mM 乳酸亚型（L-乳酸、D-乳酸、L-乳酸钠、D-乳酸钠、培养基对照）预处理的 B1188 细胞的细胞活力 （CellTiter Glo）。
（K） GEM 后用 20 mM 乳酸亚型预处理的 B1188 细胞的细胞活力 （CellTiter Glo）。
（L） L. iners+ 患者在 EBRT 之前、期间（第 1 周、第 3 周）和之后（第 5 周）宫颈肿瘤 Cytobrush 样本中的 L-乳酸水平 （BL N = 1;周1 N = 6;Wk3 N = 2;Wk5 N = 4） 和 L. iners– 患者 （BL N = 3;周1 N = 4;Wk3 N = 6;Wk 5 N = 4）。
（M） 宫颈肿瘤 Cytobrush 样本中的 D-乳酸水平。
（N） 用于培养基对照的 L-乳酸水平 （−/−），单独培养的 L. iners （+/−），单独培养的 B1188 细胞 （-/+），与用 L. iners CFS （+/+） 处理的 N. iners 处理的 B1188 细胞用于 NC-L. iners 和 CC-L. iners。
（O） 用 NYC 肉汤（对照）、NC-L. iners （N = 1） CFS 和 CC-L. iners （N = 2） CFS 处理的原代细胞 B1188 中存在的差异丰度代谢物，未经辐照 （0 Gy） 或辐照 （8 Gy），按代谢过程分组。差异丰度最高的代谢物的无监督分层聚类，按代谢过程（I，O）分组;通过 Megazyme 试剂盒 （D， E）、TC-MS （L–N） 或 HR-MS/IC-MS （I， O） 进行分析;Wilcoxon 秩和检验 （J–M）、具有均值和 SEM （G） 的未配对 t 检验或 NS p > 0.05 的双向方差分析 （F），∗p ≤ 0.05，∗∗p ≤ 0.01，∗∗∗p ≤ 0.001，∗∗∗∗p ≤ 0.0001;1 个 （B， F， J），N，2 （H–J） 或 3 （K） 个实验，每个实验重复 3 次，2 个 CC-L。合并的iners菌株（B，F，J）;1 个实验，1 个培养板，无统计比较 （D， E）。Wilcoxon 秩和检验与未调整 （J–L） 和调整 （N） 的 CTRL 相比;用 MRS 肉汤（L. crispatus 对照）、NYC Broth（L. iners 对照）以及癌症和非癌症来源的 L. iners （N = 3） 和 L. crispatus 菌株 （N = 2） （H， I） 处理的细胞的比较。归一化为未辐照介质对照 （J， K）。
见图四
与 L. iners 阴性肿瘤相比，L. iners 阳性肿瘤具有代谢改变。
图四
（A） 肿瘤代谢物相对丰度的主坐标分析 L. iners+ （N = 36） 和 L. iners– 肿瘤 （N = 30）。色散可分离性准则，p < 0.005。
（B）不同丰度代谢物的火山图。–Log10（调整后的 p 值）阈值 = 1.0;log2（倍数变化）阈值 −1 到 1。
（C）不同丰度代谢物的监督分层聚类。
（D）差异富集代谢物通路分配的棒棒糖图。按 log10 量表上的效应大小排序。∗FDR-adj p < 0.05。
通过 HR-MS 和 IC-MS （A–D） 进行分析。
见图五
癌症来源的 L. iners 获得比 NC-L. iners 产生乳酸的额外基因，并改变与内在辐射敏感性相关的通路中的癌细胞基因表达。
图五
（A） CC-L. iners （16%） vs. NC-L. iners （2%） vs. 共享 （81%） 的比较基因组分析中的重叠和独特基因。
（B） 健康 L. iners 与发育不良 L. iners 与 CC-L. iners 的比较基因组分析中的重叠基因。
（C）在比较基因组分析中，CC-L.iners和CC-L.iners（黑色）共有通路中的序贯基因以及CC-L.iners（红色）特有的基因。CC-L. iners 中的 LacG 编码可逆酶 6-磷酸-β-半乳糖苷酶，该酶将乳糖转化为半乳糖，而 CC-L. iners ers 仅利用 lacDRA 通路中的乳糖。LacR 是一种阻遏物开关，用于关闭乳糖代谢以泌乳。
（D） 富含 CC-L. iners 分离株与 NC-L. iners 分离株的代谢物通路分配的棒棒糖图。半乳糖代谢是唯一上调的途径，与 lacG 基因获取和 6-磷酸-β-半乳糖苷酶活性一致。∗FDR-adj p < 0.05。
（E） B1188 细胞的前 7 个差异表达的元核心通路。条形上方的数字表示每个通路的基因发生了显着改变。
（F） B1188 细胞的前 7 个差异表达元核心过程。条形上方的数字表示每个通路的基因发生了显着改变。
（G） 辐照 （8 Gy） 30 小时后预处理的 B1188 细胞的 Gamma H2AX 和 DAPI 荧光染色。比例尺，100 μm。
（H） 在每种 CFS 条件下用 8 Gy 处理的原代细胞 B1188 的 Gamma H2AX 动力学。
（I） 预处理的 B1188 原代细胞的抗放射性 EdU DNA 合成测定。归一化为 0 Gy（黑色）。
Log2（倍数变化）截止值为 2.0 （E， F）;1 个独立实验，1 个 （I） 或 3 个 （E） 重复，2 个 CC-L. iners 菌株合并 （E） 或单独 （I）;没有进行统计比较（H，I）。
见图六
L. iners 和基因组相似的共生产 L-乳酸细菌 （LAB） 预示着不同癌症类型的预后不良。
图六
（A） 来自非小细胞肺癌 （NSCLC） TCGA 数据集的原发性肿瘤样本中存在 （N = 57） 或不存在 （N = 990） 的无复发生存期 （RFS）。用于比较的对数秩测试。
（B） 在比较基因组分析中发现的连续操纵子，在 L. iners 分离株和沉积基因组 （CC-L. iners = 2， NC-L. iners = 2） 中发现的连续操纵子。橙色表示仅在 CC-L. iners 分离株中发现的 lacG 基因，而红色表示在所有 L. iners 分离株中发现的 lac 基因。
（C） 在TCGA数据集中鉴定遗传相似的LAB物种的流程图。
（D） 在 MDACC（肛门、阴道/外阴、子宫颈）和 TCGA 数据集（头颈部、皮肤、结直肠、肺）中基因组上与 L. iners 基因组相似的 lacGDRA 细菌的频率 （N = 46）。红框表示物种存在，并与单个数据集中的 RFS 和/或总生存期 （OS） 降低相关。蓝色框表示物种存在于数据集中，但与 RFS 或 OS 无关。
（E） 来自细菌和病毒生物信息学资源中心 （BV-BRC） 的 NSCLC 患者的 RFS，按存在 （N = 262） 或不存在 （N = 576） 的任何 lacGDRA 物种分层。用于比较的对数秩测试。
（F） 结直肠腺癌患者的 RFS，按存在 （N = 155） 或不存在 （N = 276） 任何 lacGDRA 物种进行分层。用于比较的对数秩测试。
（G） 头颈部鳞状细胞癌 （HNSCC） 患者的 RFS，按任何 lacGDRA 物种的存在 （N = 31） 或不存在 （N = 91） 进行分层。用于比较的对数秩测试。
（H） HNSCC 患者的 RFS 分层，根据存在至少一种产专性 D-乳酸的 lacGDRA 细菌物种（Leptotrichia trevisanii 或 Leptotrichia wadei）和没有产专性 L-乳酸的 lacGDRA 细菌菌种 （N = 64） 与至少一种产 L-乳酸的菌种（副加醋酸乳杆菌、婴儿链球菌、约翰逊乳杆菌、链球菌属口服分类群 064，或副干酪乳杆菌;N = 15）。用于比较的对数秩测试。
（I） HNSCC 患者的 OS 分层为存在至少一种产专性 D-乳酸的 lacGDRA 细菌物种（Leptotrichia trevisanii 或 Leptotrichia wadei）和没有产专性 L-乳酸的 lacGDRA 细菌菌种 （N = 77） 与至少一种产 L-乳酸的菌种（副加塞氏乳杆菌、婴儿链球菌、约翰逊乳杆菌、链球菌属口服分类群 064，或副干酪乳杆菌;N = 29）。Kaplan-Meier生存曲线与对数秩检验进行比较。（A、E-I）。用于比较的对数秩测试。
02
研究结论
在这里，我们证明了宫颈癌相关的 L. iners，一种产生专性 L-乳酸的兼性厌氧细菌，通过有效的 L-乳酸产生和肿瘤中的代谢重新布线来诱导治疗耐药性。这得到了强大的临床关联、L. iners 或 L-乳酸诱导化疗和放疗耐药性以及其在体外和放疗后在肿瘤中的高乳酸产生的支持。这一发现不仅限于宫颈肿瘤细菌或宫颈肿瘤;相反，我们认为肿瘤相关LAB以与所描述的肿瘤-基质或肿瘤-免疫细胞相互作用类似的方式参与乳酸介导的代谢重新布线，在许多癌症类型中具有广泛的意义。
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