RIP实验详细操作方法：
一、细胞裂解(对于单层细胞或贴壁细胞)
1.用10 mL冰冷的PBS洗涤培养瓶或平板上的细胞两次。
2.加入10 mL冰冷的PBS。从每个培养瓶或平板上刮下细胞，然后转移到离心管。
3.通过在4℃下以1500 rpm离心5分钟来收集细胞，并丢弃上清液。
4.在等体积的完全RIP裂解缓冲液中重新悬浮细胞颗粒。通过上下移液混合，直到细胞被分散，混合物呈现均匀。将裂解液放在冰上孵育5 min。这一步允许低渗RIP缓冲液膨胀细胞。将每个裂解液的~200 μL分配到无核酸酶的微离心管中，并在-80℃下保存。
二、 免疫沉淀用磁珠的制备
1.将50 µL的磁珠悬浮液转移到每个管上（分组：Ab vs IgG）。
2.每管中加入0.5 mL RIP洗涤缓冲液，短暂涡旋,将管子放在磁性分离器上,去上清。
3.从磁铁上取下试管。每管中加入0.5 mL RIP洗涤缓冲液，短暂涡旋。
4.将试管放在磁性分离器上，然后弃用上清液。
5.从磁铁上取出试管，并在100 µL的RIP洗涤缓冲液中重新悬浮珠子。在试管中加入目标抗体的~5 µg。
6.在室温下旋转孵育30分钟。
7.将试管短暂离心，放置在磁性分离器上，弃用上清液。
8.从磁铁上取下试管。每管中加入0.5 mL RIP洗涤缓冲液，短暂涡旋。
9.将试管放在磁性分离器上，然后弃用上清液。重复清洗1次
10.从磁铁上取下试管。每管中加入0.5 mL RIP洗涤缓冲液，短暂涡旋。把管子放在冰上。
三、RNA结合蛋白-RNA复合物的免疫沉淀（RIP）免疫沉淀
1.制备RIP免疫共沉淀缓冲液。每次免疫沉淀需要900 μL的RIP免疫沉淀缓冲液。每个反应在860 µL的RIP洗涤缓冲液中加入35 μL的0.5 M EDTA和5 µL的RNase抑制剂。
2.将第二节第10步中的试管放在磁性分离器上，并丢弃上清液。在每根试管中加入900 µL的RIP免疫共沉淀缓冲液。
3.快速解冻RIP裂解液（来自第一部分），在4℃下以14000 rpm离心10分钟。取出100 µL的上清液，加入RIP免疫沉淀缓冲液中的每个磁珠-抗体复合物。免疫共沉淀反应的最终体积将为1.0 mL。
4.取出10 µL的RIP裂解液上清液，并将其放入一个新的试管中，并贴上“input”的标签。将该样本存储在-80°C，直到开始RNA纯化（第四节）。这代表“10%的input”，将用于生成标准曲线或用于RT-PCR方法的比较（实时或终点）。
5.取出10 µL的RIP裂解液上清液，通过蛋白印迹法检测目标RNA binding蛋白的表达。将10 µL的2 X SDS-PAGE loading 缓冲液加入到10 µL的RIP裂解液中，然后在95°C下加热。RIP裂解液可直接应用于SDS-PAGE。
6.将所有的试管在4°C下旋转孵育3小时至过夜。
7.将免疫沉淀管短暂离心，放置在磁性分离器上，弃用上清液。
8.从磁铁上取下试管。每管中加入0.5 mL RIP洗涤缓冲液，短暂涡旋。(重复清洗5次）
9.在最后一次洗涤中，将500 µL的珠子悬液中各取出50µL，通过免疫印迹法检测免疫沉淀的效率。在1X SDS-PAGE加载缓冲液中重新悬浮珠子，然后在95°C加热，可以洗脱蛋白质。然后可以离心，上清液直接应用于SDS-PAGE上。
四、RNA纯化
1.制备蛋白酶K缓冲液。每个免疫沉淀需要150 µL蛋白酶K缓冲液，包含117 µL RIP洗涤缓冲液，15 µL 10% SDS，18 µL 10 mg/mL蛋白酶K。
2.在150µL的蛋白酶K缓冲液中重新悬浮第三节第8步中的每个免疫沉淀。
3.将第三节第4步的input样品解冻，在试管中加入107 µL RIP洗涤缓冲液、15 µL 10% SDS和18 µL蛋白酶K，使体积提高到150 µL。
4.将所有试管在55°C下摇晃孵育30分钟以消化蛋白质。
5.孵育后，将管短暂离心，并将管放置在磁分离器上。将上清液转移到一个新的试管中。
6.在上清液的试管中加入250 µL RIP洗涤缓冲液。
7.在每根试管中加入400 µL的苯酚：氯仿：异戊醇。涡旋15秒，在室温下以14000 rpm离心10分钟，以分离相位。
8.小心地取出350 μL水相，将其放入新管中。加入400 µL的氯仿。涡旋15秒，在室温下以14000 rpm离心10分钟，以分离相位。
9.小心地取出300 μL的水相，然后放入一个新的试管中。
10.在每根试管中加入50 µL盐溶液I、15 µL盐溶液II、5 µL沉淀增强剂和850 µL无水乙醇。混合并在-80°C下保持1小时至过夜，以沉淀RNA。
11.在4°C下以14000 rpm离心30分钟，小心丢弃上清液。
12.用80%的乙醇清洗沉淀一次。在4°C下以14000 rpm离心15分钟。小心地弃出上清液，晾干沉淀。重新悬浮在10到20 µL的无RNase的水中，并将管子放在冰上。
五、将RNA反转录成cDNA
1.标记适当数量的0.2 mL PCR管，以供分析的样本数量，并放在冰上。
2.将9 μL（最多2 μg）的RNA加入PCR管中，放在冰上。
3.在每个PCR反应管的在冰上加入适量的试剂，如表所示
4.将PCR反应管置于热循环器中。
5.启动以下RT反应程序：37℃,1 h; 95℃, 5 min, 4℃保存。
6.取下PCR管。用180 μL无核酸酶水（稀释10倍）稀释产物。产物可以存储在-20°C。
六、 qPCR检测
在qPCR管中配制如下混合液
2.按下列条件进行qPCR反应
七、实验结果
7.1抗体在细胞样本中表达验证（质控1）例如：
结果说明：目的蛋白在目的样本中表达正常，说明抗体有效，样本中蛋白没有发生降解，可进行后续RIP实验。
7.2RIP-WB验证（质控2）例如：
结果说明：目标蛋白的抗体把自身蛋白特异性沉淀下来，说明该抗体可以进行IP实验。
7.3 RIP富集后的RNA Qubit检测浓度（seq项目-质控3）例如：
结果说明：一般IP组产物RNA浓度远大于阴性对照组IgG产物浓度。
7.4 qPCR结果
例如：
结果说明：通过RIP-qPCR验证circRNA和FOXA1/TET1互作。
本次实验的目的是使用RIP-seq或者RIP-qPCR的方法，通过在目的细胞中运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，经过分离纯化并对结合在复合物上的RNA进行测序或qPCR分析，寻找目标蛋白的互作RNA分子，或在不同遗传背景或处理条件下的互作变化。
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参考文献：hsa_circ_0007919 induces LIG1 transcription by binding to FOXA1/TET1 to enhance the DNA damage response and promote gemcitabine resistance in pancreatic ductal adenocarcinoma. Molecular cancer. 2023.
一、细胞裂解(对于单层细胞或贴壁细胞)
1.用10 mL冰冷的PBS洗涤培养瓶或平板上的细胞两次。
2.加入10 mL冰冷的PBS。从每个培养瓶或平板上刮下细胞，然后转移到离心管。
3.通过在4℃下以1500 rpm离心5分钟来收集细胞，并丢弃上清液。
4.在等体积的完全RIP裂解缓冲液中重新悬浮细胞颗粒。通过上下移液混合，直到细胞被分散，混合物呈现均匀。将裂解液放在冰上孵育5 min。这一步允许低渗RIP缓冲液膨胀细胞。将每个裂解液的~200 μL分配到无核酸酶的微离心管中，并在-80℃下保存。
二、 免疫沉淀用磁珠的制备
1.将50 µL的磁珠悬浮液转移到每个管上（分组：Ab vs IgG）。
2.每管中加入0.5 mL RIP洗涤缓冲液，短暂涡旋,将管子放在磁性分离器上,去上清。
3.从磁铁上取下试管。每管中加入0.5 mL RIP洗涤缓冲液，短暂涡旋。
4.将试管放在磁性分离器上，然后弃用上清液。
5.从磁铁上取出试管，并在100 µL的RIP洗涤缓冲液中重新悬浮珠子。在试管中加入目标抗体的~5 µg。
6.在室温下旋转孵育30分钟。
7.将试管短暂离心，放置在磁性分离器上，弃用上清液。
8.从磁铁上取下试管。每管中加入0.5 mL RIP洗涤缓冲液，短暂涡旋。
9.将试管放在磁性分离器上，然后弃用上清液。重复清洗1次
10.从磁铁上取下试管。每管中加入0.5 mL RIP洗涤缓冲液，短暂涡旋。把管子放在冰上。
三、RNA结合蛋白-RNA复合物的免疫沉淀（RIP）免疫沉淀
1.制备RIP免疫共沉淀缓冲液。每次免疫沉淀需要900 μL的RIP免疫沉淀缓冲液。每个反应在860 µL的RIP洗涤缓冲液中加入35 μL的0.5 M EDTA和5 µL的RNase抑制剂。
2.将第二节第10步中的试管放在磁性分离器上，并丢弃上清液。在每根试管中加入900 µL的RIP免疫共沉淀缓冲液。
3.快速解冻RIP裂解液（来自第一部分），在4℃下以14000 rpm离心10分钟。取出100 µL的上清液，加入RIP免疫沉淀缓冲液中的每个磁珠-抗体复合物。免疫共沉淀反应的最终体积将为1.0 mL。
4.取出10 µL的RIP裂解液上清液，并将其放入一个新的试管中，并贴上“input”的标签。将该样本存储在-80°C，直到开始RNA纯化（第四节）。这代表“10%的input”，将用于生成标准曲线或用于RT-PCR方法的比较（实时或终点）。
5.取出10 µL的RIP裂解液上清液，通过蛋白印迹法检测目标RNA binding蛋白的表达。将10 µL的2 X SDS-PAGE loading 缓冲液加入到10 µL的RIP裂解液中，然后在95°C下加热。RIP裂解液可直接应用于SDS-PAGE。
6.将所有的试管在4°C下旋转孵育3小时至过夜。
7.将免疫沉淀管短暂离心，放置在磁性分离器上，弃用上清液。
8.从磁铁上取下试管。每管中加入0.5 mL RIP洗涤缓冲液，短暂涡旋。(重复清洗5次）
9.在最后一次洗涤中，将500 µL的珠子悬液中各取出50µL，通过免疫印迹法检测免疫沉淀的效率。在1X SDS-PAGE加载缓冲液中重新悬浮珠子，然后在95°C加热，可以洗脱蛋白质。然后可以离心，上清液直接应用于SDS-PAGE上。
四、RNA纯化
1.制备蛋白酶K缓冲液。每个免疫沉淀需要150 µL蛋白酶K缓冲液，包含117 µL RIP洗涤缓冲液，15 µL 10% SDS，18 µL 10 mg/mL蛋白酶K。
2.在150µL的蛋白酶K缓冲液中重新悬浮第三节第8步中的每个免疫沉淀。
3.将第三节第4步的input样品解冻，在试管中加入107 µL RIP洗涤缓冲液、15 µL 10% SDS和18 µL蛋白酶K，使体积提高到150 µL。
4.将所有试管在55°C下摇晃孵育30分钟以消化蛋白质。
5.孵育后，将管短暂离心，并将管放置在磁分离器上。将上清液转移到一个新的试管中。
6.在上清液的试管中加入250 µL RIP洗涤缓冲液。
7.在每根试管中加入400 µL的苯酚：氯仿：异戊醇。涡旋15秒，在室温下以14000 rpm离心10分钟，以分离相位。
8.小心地取出350 μL水相，将其放入新管中。加入400 µL的氯仿。涡旋15秒，在室温下以14000 rpm离心10分钟，以分离相位。
9.小心地取出300 μL的水相，然后放入一个新的试管中。
10.在每根试管中加入50 µL盐溶液I、15 µL盐溶液II、5 µL沉淀增强剂和850 µL无水乙醇。混合并在-80°C下保持1小时至过夜，以沉淀RNA。
11.在4°C下以14000 rpm离心30分钟，小心丢弃上清液。
12.用80%的乙醇清洗沉淀一次。在4°C下以14000 rpm离心15分钟。小心地弃出上清液，晾干沉淀。重新悬浮在10到20 µL的无RNase的水中，并将管子放在冰上。
五、将RNA反转录成cDNA
1.标记适当数量的0.2 mL PCR管，以供分析的样本数量，并放在冰上。
2.将9 μL（最多2 μg）的RNA加入PCR管中，放在冰上。
3.在每个PCR反应管的在冰上加入适量的试剂，如表所示
4.将PCR反应管置于热循环器中。
5.启动以下RT反应程序：37℃,1 h; 95℃, 5 min, 4℃保存。
6.取下PCR管。用180 μL无核酸酶水（稀释10倍）稀释产物。产物可以存储在-20°C。
六、 qPCR检测
在qPCR管中配制如下混合液
2.按下列条件进行qPCR反应
七、实验结果
7.1抗体在细胞样本中表达验证（质控1）例如：
结果说明：目的蛋白在目的样本中表达正常，说明抗体有效，样本中蛋白没有发生降解，可进行后续RIP实验。
7.2RIP-WB验证（质控2）例如：
结果说明：目标蛋白的抗体把自身蛋白特异性沉淀下来，说明该抗体可以进行IP实验。
7.3 RIP富集后的RNA Qubit检测浓度（seq项目-质控3）例如：
结果说明：一般IP组产物RNA浓度远大于阴性对照组IgG产物浓度。
7.4 qPCR结果
例如：
结果说明：通过RIP-qPCR验证circRNA和FOXA1/TET1互作。
本次实验的目的是使用RIP-seq或者RIP-qPCR的方法，通过在目的细胞中运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，经过分离纯化并对结合在复合物上的RNA进行测序或qPCR分析，寻找目标蛋白的互作RNA分子，或在不同遗传背景或处理条件下的互作变化。
广州基云生物拥有资深的项目管理专家和经验丰富的技术团队，提供专业的研究方案、严格项目质控、科学的数据分析，为互作机制提供专业建议，助力快速获取互作机制分子，突破互作机制研究瓶颈难题。
参考文献：hsa_circ_0007919 induces LIG1 transcription by binding to FOXA1/TET1 to enhance the DNA damage response and promote gemcitabine resistance in pancreatic ductal adenocarcinoma. Molecular cancer. 2023.
