大家好，今天跟大家分享的题为 CSTF2 mediated mRNA N6-methy ladenosine modifi cation drives pancr eatic ductal adenocar cinoma m6A subtypes（CSTF2介导的信使核糖核酸N6-甲基腺苷修饰驱动胰腺导管腺癌m6A亚型）胰腺导管腺癌 (PDAC) 是世界上第四大癌症相关死亡原因，通常在晚期才诊断出来。由于缺乏有效的早期诊断、治疗方法以及治疗药物难以到达肿瘤部位，PDAC 的治疗效果并不好。
01
研究背景
N6-甲基腺苷（M6A）基因转录本的修饰在癌症中起着至关重要的作用。在这里，我们报告了转录组学 m6对 65 名胰腺导管腺癌 （PDAC） 患者的 98 份组织样本进行分析。我们确定 17,996 米6与相邻的正常组织相比，PDAC 中的 A 峰具有 195 个高甲基化和 93 个低甲基化。微分 m6A 修饰区分了两种具有不同预后结果的 PDAC 亚型。这两种亚型的形成是由新发现的 m 驱动的6共转录调节 m 的调节因子 CSTF26通过在基因转录过程中减慢 RNA Pol II 延伸速率的装置。我们发现大多数 CSTF2 调节的 m6AS对宿主基因的RNA水平有积极影响，CSTF2调节的m6由于主要由IGF2BP2识别，m6一种稳定 mRNA 的读取器。这些结果为PDAC的精准医疗提供了一种有前途的PDAC亚型策略和潜在的治疗靶点。
见图一
m的转录组范围图谱6PDAC的修改。
图一
a 显示已鉴定 RNA m 的 Circos 图6对 65 个 PDAC 肿瘤和 33 个正常组织样本进行了修饰。每个条形代表一个 m6A 和条形高度表示具有 m 的样品编号6一个。红色虚线圆圈表示具有 m 的样品编号的截止值（设置为 5）6A。
b 序列标志，代表以 m 为单位的丰富序列主题6正如MEME工具所分析的那样。
c m 的位置分布6就像在 mRNA 中一样。
d 热图显示不同的 m633 个配对的 PDAC 肿瘤和正常样本以及 32 个未配对的 PDAC 肿瘤样本中的 A 水平（FDR <配对 Wilcoxon 检验的 0.1）。每行代表一个差异甲基化的 m6A，每列代表一个样本。
e 29 个异常 m 的倍数变化的 Spearman 相关性6As（肿瘤/正常）由 m 确定6A-seq 或 MeRIP-qPCR。
f 显著富集高甲基化 m 的标志6As（左图）或低甲基化 m6如（右图）通过反应组通路分析。
g m 的丰度6肿瘤组织和邻近正常组织中指示的 RNA 中的 A 以 m6A-序列。数字表示 m 的范围6A 信号。
h 由 m 鉴定的指示 RNA 的丰度6肿瘤组织 （n = 33） 和邻近正常组织 （n = 33） 中的 A-seq。箱线图表示中位数（中线）、第 25、75 个百分位数（方框）以及第 5 个和第 95 个百分位数（晶须）。P值来自Wilcoxon秩和检验。
见图二
通过转录组范围m对PDAC进行亚型分型6A 修改。
图二
a 通过差异区分 PDAC 作为 S1 或 S2 亚型6A。
b 热图显示显著差异（Wilcoxon 秩和检验的 FDR < 0.1）m6A在正常、S1和S2 PDAC组织中。
c 维恩图显示超（上图）或低甲基化 m 之间有很大的重叠6S2 PDAC亚型与S1 PDAC亚型的A（下图）以及PDAC肿瘤与正常的A（下图）。
d m 之间的关联6A 定义的 PDAC 亚型和临床（性别、年龄、吸烟状况、饮酒状况、肿瘤分期、分化、神经浸润、血管浸润和淋巴结转移）或分子特征（转录亚型）。
e Kaplan-Meier 对不同 m 的 PDAC 患者的无进展生存期（PFS，上图）和总生存期（OS，下图）的估计值6子类型。
见图三
CSTF2是促进mRNA m的关键蛋白6S2 PDAC亚型中的沉积物。
图三
a RNA结合蛋白（RBP）表达与高甲基化m之间的Spearman相关性6与 S2 PDAC 子类型相同。x 轴表示对数10（FDR） 分析 RBP 相关高甲基化 m 的富集6与背景相反。y 轴表示每个 RBP 对高甲基化 m 的贡献分数6A 基于随机森林分析。
b 通过RNA测序（左图）或qRT-PCR（右图）确定两种PDAC亚型的CSTF2表达水平。框中间的线绘制在中位数处，而上铰链和下铰链表示第 25 个和第 75 个百分位数。**P < 0.01 的 Wilcoxon 秩和检验。
c CSTF2对m6PANC-1 细胞中的 A 水平。有 2286 个高甲基化 m6砷（红色）和 14,342 个低甲基化 m6在具有 CSTF2 敲低 （KD） 的细胞中，As（蓝色）。
d CSTF2 对 m 的影响6SW1990 细胞中的 A 水平。有 1507 个高甲基化 m6砷（红色）和 11,544 个低甲基化 m6在具有 CSTF2 敲低 （KD） 的细胞中，As（蓝色）。
e， f m 的散点图6PANC-1 细胞 （e） 和 SW1990 细胞 （f） 中的 A 水平，有或没有强制 CSTF2 表达。有 8804 个高甲基化 m6As（红色）和 4602 低甲基化 m6在 PANC-1 细胞中 CSTF2 过表达的细胞中，As（蓝色）。有 8554 个高甲基化 m6As（红色）和 4450 低甲基化 m6在 SW1990 细胞中 CSTF2 过表达的细胞中，As（蓝色）。
g 维恩图显示低甲基化 m 之间的重叠6与CSTF2敲低和高甲基化m的细胞一样6与CSTF2过表达的细胞一样。h 综合基因组学观察器 （IGV） 图显示不同丰度的 m6在具有或不具有 CSTF2 KD 的 PDAC 细胞之间描述的转录本中。
i 维恩图显示具有 hyper m 的 mRNA6与 S2 PDAC 亚型和 mRNA 一样，具有 hypo m6与具有CSTF2 KD的PDAC细胞一样。截止显著差异 m6甲基化定义为 c−f 中的│倍数变化│>1.2。
见图四
敲低CSTF2抑制PDAC细胞的增殖和转移。
图四
a， b CSTF2 KD抑制PDAC细胞增殖，通过电阻抗测量，表示为细胞指数降低（a）或通过CCK-8测定（b）测量。a、b 的数据是 S.D. ± 的平均值 （n = 3）。
c CSTF2 KD抑制PDAC细胞集落形成。上图是菌落形成的代表性图片;下图显示了相对菌落形成活动的定量统计数据（平均值± S.E.M.，n = 3）。
d CSTF2 KD抑制PDAC细胞迁移和侵袭，通过transwell测定法确定。上图是代表性的图片，显示了不同的细胞迁移和侵袭能力;下方面板显示了迁移和入侵能力的定量统计数据。数据是三个独立实验中 （n = 3） 中 （n = 3） 中 S.E.M. 的平均±值。比例尺，200μm。
e CSTF2 对裸鼠体内 PDAC 细胞来源的异种移植肿瘤生长的影响。图中显示了在实验结束时获得的皮下异种移植物（左图）和异种移植物生长曲线（右图）。
f CSTF2 对裸鼠 （n = 5） 通过尾静脉注射细胞的 PDAC 细胞肺定位的影响。左图显示了注射细胞后第 42 天的代表性生物发光成像，右图显示了定量的管腔强度。数据代表每组五只小鼠的± S.E.M. 的平均值。a−d的数据来自三个独立的实验。
见图五
CSTF2介导m6通过延缓伸长率进行沉积。
图五
a， b CSTF2 结合位点和 m6PANC-1 （a） 或 HEK293 细胞 （b） 中 RNA 中的 A 位点。线图显示了 CSTF2 结合位点（左图）和 m 之间的距离62 kb 区域内 RNA 中的 A 位点和维恩图显示了相应的重叠比例（右图）。Fisher 精确检验的 P 值。c CSTF2 和 RNA Pol II 在 PANC-1 细胞中的 DNA 结合位点的共定位。
d， e 富含 Pol II 结合 （d） 或具有显着 Pol II 结合变化 （e） 的基因经历了更显着的 m6CSTF2-KD的变化。d、e的P值来自Wilcoxon秩和检验。
f PANC-1 细胞中 CSTF2 的 DNA 和 RNA 结合位点的共定位。紫线和蓝线分别表示与Pol II CUT&Tag峰重叠（紫色）或不重叠（蓝色）的CSTF2 CLIP峰。
g CSTF2 和 RNA 的 DNA 结合位点的共定位 m6PANC-1 细胞中的 A 位点。紫线和蓝线代表CSTF2靶向m6峰分别与Pol II CUT&Tag峰重叠（紫色）或不重叠（蓝色）。
h 沿 CSTF2 靶 mRNA 的 RNA Pol II 密度比较（左：CSTF2 靶 RNA;右图：CSTF2-KD 上 PANC-1 细胞中的 CSTF2 非靶标 RNA）。
i 显示的是经历 m 的成绩单的代表性曲目6A 水平和 Pol II 结合密度在 CSTF2 KD 上发生变化。
j， k PANC-1 细胞中 5-乙炔基尿苷 （EU） 标记的代表性图像（左图）显示了三个独立实验的 CSTF2 KD （j） 或过表达 （k） 的影响，以及来自一个代表性实验的 EU 信号的定量分析（右图）。比例尺，100μm。箱线图表示中位数（中线）、第 25、75 个百分位数（方框）以及第 5 个和第 95 个百分位数（晶须）（单元格编号：n = 27、31 和 29 用于 KD 对照、CSTF2-KD#1 和 CSTF2-KD#2;对照组和 CSTF2 OE 分别为 n = 29 和 24） l， m 显示 CSTF2 KD （l） 或过表达 （m） 对 PANC-1 细胞中 Pol II 和 METTL3 相互作用的影响。n 显示 mRNA 与 hypo-m 之间的重叠6与 CSTF2 KD 和 METTL3 KD 一样。
o，p CLIP-qPCR显示，CSTF2 KD损伤（o）但过表达增强（p）METTL3与PANC-1靶转录本的结合。 数据是 o、p 中三个独立实验的平均 ± S.E.M.。
见图六
异常 m6A 增强 mRNA 稳定性。
图六
a m级的相关性6与宿主RNA的水平一样。超上，两者的水平都增加6S2 PDAC与S1 PDAC中的As及其宿主RNA;低下，降低两个 m 的水平6S2 PDAC与S1 PDAC中的As及其宿主RNA水平;低上，m 降低6与S1 PDAC相比，S2 PDAC中的RNA水平有所增加;变化不显著，S2 PDAC与S1 PDAC的RNA水平没有显著变化。
b PANC-1 细胞中 CSTF2 敲低时差异表达的 CSTF2 靶 RNA 的瀑布图。
c 基于 dCas13 的 m 示意图6编辑系统。
d 相对 m6转染 dCas13b-ALKBH5 和非靶标 gRNA 或靶向 m 后，MeRIP-qPCR 检测到的 CENPF、WNT7B、NTSR1 转录本富集6分别是特定 RNA 的 A。
e 转染 dCas13b-ALKBH5 和非靶标 gRNA 或靶向 gRNA 时，CLIP-qPCR 检测到的指示转录本的相对IGF2BP2富集 m6分别为特异性 RNA 的 A。
f， g 转染 dCas13b-ALKBH5 和非靶标 gRNA 或靶向 gRNA 时，qRT-PCR 检测到的 CENPF、WNT7B、NTSR1 的相对 mRNA 水平 （f） 和半衰期 （g） m6分别表示 RNA 的 A。
h， i 操作 m 时 qRT-PCR 检测到的 CENPF、WNT7B、NTSR1 的相对 mRNA 水平 （h） 和半衰期 （i）6基于 dCas13 的站点 m6带或不带强制表达IGF2BP2的救援编辑系统。数据是 d−i 中三个独立实验的平均 ± S.E.M.。
02
研究结论
总之，我们已经全面破译了转录组范围的m6PDAC中的mRNA修饰。我们已经确定 CSTF2 促进 m6mRNA的修饰和IGF2BP2增强了mRNA的稳定性，并具有高甲基化的m。6As，形成 CSTF2-m6A-IGF2BP2轴（图1）。7）.这个m的异常6修饰相关轴可能有助于PDAC的发展和进展，因此在PDAC精准医疗中具有潜在的临床应用。
好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理. 数据分析等支持.也随时可以联系我们。
01
研究背景
N6-甲基腺苷（M6A）基因转录本的修饰在癌症中起着至关重要的作用。在这里，我们报告了转录组学 m6对 65 名胰腺导管腺癌 （PDAC） 患者的 98 份组织样本进行分析。我们确定 17,996 米6与相邻的正常组织相比，PDAC 中的 A 峰具有 195 个高甲基化和 93 个低甲基化。微分 m6A 修饰区分了两种具有不同预后结果的 PDAC 亚型。这两种亚型的形成是由新发现的 m 驱动的6共转录调节 m 的调节因子 CSTF26通过在基因转录过程中减慢 RNA Pol II 延伸速率的装置。我们发现大多数 CSTF2 调节的 m6AS对宿主基因的RNA水平有积极影响，CSTF2调节的m6由于主要由IGF2BP2识别，m6一种稳定 mRNA 的读取器。这些结果为PDAC的精准医疗提供了一种有前途的PDAC亚型策略和潜在的治疗靶点。
见图一
m的转录组范围图谱6PDAC的修改。
图一
a 显示已鉴定 RNA m 的 Circos 图6对 65 个 PDAC 肿瘤和 33 个正常组织样本进行了修饰。每个条形代表一个 m6A 和条形高度表示具有 m 的样品编号6一个。红色虚线圆圈表示具有 m 的样品编号的截止值（设置为 5）6A。
b 序列标志，代表以 m 为单位的丰富序列主题6正如MEME工具所分析的那样。
c m 的位置分布6就像在 mRNA 中一样。
d 热图显示不同的 m633 个配对的 PDAC 肿瘤和正常样本以及 32 个未配对的 PDAC 肿瘤样本中的 A 水平（FDR <配对 Wilcoxon 检验的 0.1）。每行代表一个差异甲基化的 m6A，每列代表一个样本。
e 29 个异常 m 的倍数变化的 Spearman 相关性6As（肿瘤/正常）由 m 确定6A-seq 或 MeRIP-qPCR。
f 显著富集高甲基化 m 的标志6As（左图）或低甲基化 m6如（右图）通过反应组通路分析。
g m 的丰度6肿瘤组织和邻近正常组织中指示的 RNA 中的 A 以 m6A-序列。数字表示 m 的范围6A 信号。
h 由 m 鉴定的指示 RNA 的丰度6肿瘤组织 （n = 33） 和邻近正常组织 （n = 33） 中的 A-seq。箱线图表示中位数（中线）、第 25、75 个百分位数（方框）以及第 5 个和第 95 个百分位数（晶须）。P值来自Wilcoxon秩和检验。
见图二
通过转录组范围m对PDAC进行亚型分型6A 修改。
图二
a 通过差异区分 PDAC 作为 S1 或 S2 亚型6A。
b 热图显示显著差异（Wilcoxon 秩和检验的 FDR < 0.1）m6A在正常、S1和S2 PDAC组织中。
c 维恩图显示超（上图）或低甲基化 m 之间有很大的重叠6S2 PDAC亚型与S1 PDAC亚型的A（下图）以及PDAC肿瘤与正常的A（下图）。
d m 之间的关联6A 定义的 PDAC 亚型和临床（性别、年龄、吸烟状况、饮酒状况、肿瘤分期、分化、神经浸润、血管浸润和淋巴结转移）或分子特征（转录亚型）。
e Kaplan-Meier 对不同 m 的 PDAC 患者的无进展生存期（PFS，上图）和总生存期（OS，下图）的估计值6子类型。
见图三
CSTF2是促进mRNA m的关键蛋白6S2 PDAC亚型中的沉积物。
图三
a RNA结合蛋白（RBP）表达与高甲基化m之间的Spearman相关性6与 S2 PDAC 子类型相同。x 轴表示对数10（FDR） 分析 RBP 相关高甲基化 m 的富集6与背景相反。y 轴表示每个 RBP 对高甲基化 m 的贡献分数6A 基于随机森林分析。
b 通过RNA测序（左图）或qRT-PCR（右图）确定两种PDAC亚型的CSTF2表达水平。框中间的线绘制在中位数处，而上铰链和下铰链表示第 25 个和第 75 个百分位数。**P < 0.01 的 Wilcoxon 秩和检验。
c CSTF2对m6PANC-1 细胞中的 A 水平。有 2286 个高甲基化 m6砷（红色）和 14,342 个低甲基化 m6在具有 CSTF2 敲低 （KD） 的细胞中，As（蓝色）。
d CSTF2 对 m 的影响6SW1990 细胞中的 A 水平。有 1507 个高甲基化 m6砷（红色）和 11,544 个低甲基化 m6在具有 CSTF2 敲低 （KD） 的细胞中，As（蓝色）。
e， f m 的散点图6PANC-1 细胞 （e） 和 SW1990 细胞 （f） 中的 A 水平，有或没有强制 CSTF2 表达。有 8804 个高甲基化 m6As（红色）和 4602 低甲基化 m6在 PANC-1 细胞中 CSTF2 过表达的细胞中，As（蓝色）。有 8554 个高甲基化 m6As（红色）和 4450 低甲基化 m6在 SW1990 细胞中 CSTF2 过表达的细胞中，As（蓝色）。
g 维恩图显示低甲基化 m 之间的重叠6与CSTF2敲低和高甲基化m的细胞一样6与CSTF2过表达的细胞一样。h 综合基因组学观察器 （IGV） 图显示不同丰度的 m6在具有或不具有 CSTF2 KD 的 PDAC 细胞之间描述的转录本中。
i 维恩图显示具有 hyper m 的 mRNA6与 S2 PDAC 亚型和 mRNA 一样，具有 hypo m6与具有CSTF2 KD的PDAC细胞一样。截止显著差异 m6甲基化定义为 c−f 中的│倍数变化│>1.2。
见图四
敲低CSTF2抑制PDAC细胞的增殖和转移。
图四
a， b CSTF2 KD抑制PDAC细胞增殖，通过电阻抗测量，表示为细胞指数降低（a）或通过CCK-8测定（b）测量。a、b 的数据是 S.D. ± 的平均值 （n = 3）。
c CSTF2 KD抑制PDAC细胞集落形成。上图是菌落形成的代表性图片;下图显示了相对菌落形成活动的定量统计数据（平均值± S.E.M.，n = 3）。
d CSTF2 KD抑制PDAC细胞迁移和侵袭，通过transwell测定法确定。上图是代表性的图片，显示了不同的细胞迁移和侵袭能力;下方面板显示了迁移和入侵能力的定量统计数据。数据是三个独立实验中 （n = 3） 中 （n = 3） 中 S.E.M. 的平均±值。比例尺，200μm。
e CSTF2 对裸鼠体内 PDAC 细胞来源的异种移植肿瘤生长的影响。图中显示了在实验结束时获得的皮下异种移植物（左图）和异种移植物生长曲线（右图）。
f CSTF2 对裸鼠 （n = 5） 通过尾静脉注射细胞的 PDAC 细胞肺定位的影响。左图显示了注射细胞后第 42 天的代表性生物发光成像，右图显示了定量的管腔强度。数据代表每组五只小鼠的± S.E.M. 的平均值。a−d的数据来自三个独立的实验。
见图五
CSTF2介导m6通过延缓伸长率进行沉积。
图五
a， b CSTF2 结合位点和 m6PANC-1 （a） 或 HEK293 细胞 （b） 中 RNA 中的 A 位点。线图显示了 CSTF2 结合位点（左图）和 m 之间的距离62 kb 区域内 RNA 中的 A 位点和维恩图显示了相应的重叠比例（右图）。Fisher 精确检验的 P 值。c CSTF2 和 RNA Pol II 在 PANC-1 细胞中的 DNA 结合位点的共定位。
d， e 富含 Pol II 结合 （d） 或具有显着 Pol II 结合变化 （e） 的基因经历了更显着的 m6CSTF2-KD的变化。d、e的P值来自Wilcoxon秩和检验。
f PANC-1 细胞中 CSTF2 的 DNA 和 RNA 结合位点的共定位。紫线和蓝线分别表示与Pol II CUT&Tag峰重叠（紫色）或不重叠（蓝色）的CSTF2 CLIP峰。
g CSTF2 和 RNA 的 DNA 结合位点的共定位 m6PANC-1 细胞中的 A 位点。紫线和蓝线代表CSTF2靶向m6峰分别与Pol II CUT&Tag峰重叠（紫色）或不重叠（蓝色）。
h 沿 CSTF2 靶 mRNA 的 RNA Pol II 密度比较（左：CSTF2 靶 RNA;右图：CSTF2-KD 上 PANC-1 细胞中的 CSTF2 非靶标 RNA）。
i 显示的是经历 m 的成绩单的代表性曲目6A 水平和 Pol II 结合密度在 CSTF2 KD 上发生变化。
j， k PANC-1 细胞中 5-乙炔基尿苷 （EU） 标记的代表性图像（左图）显示了三个独立实验的 CSTF2 KD （j） 或过表达 （k） 的影响，以及来自一个代表性实验的 EU 信号的定量分析（右图）。比例尺，100μm。箱线图表示中位数（中线）、第 25、75 个百分位数（方框）以及第 5 个和第 95 个百分位数（晶须）（单元格编号：n = 27、31 和 29 用于 KD 对照、CSTF2-KD#1 和 CSTF2-KD#2;对照组和 CSTF2 OE 分别为 n = 29 和 24） l， m 显示 CSTF2 KD （l） 或过表达 （m） 对 PANC-1 细胞中 Pol II 和 METTL3 相互作用的影响。n 显示 mRNA 与 hypo-m 之间的重叠6与 CSTF2 KD 和 METTL3 KD 一样。
o，p CLIP-qPCR显示，CSTF2 KD损伤（o）但过表达增强（p）METTL3与PANC-1靶转录本的结合。 数据是 o、p 中三个独立实验的平均 ± S.E.M.。
见图六
异常 m6A 增强 mRNA 稳定性。
图六
a m级的相关性6与宿主RNA的水平一样。超上，两者的水平都增加6S2 PDAC与S1 PDAC中的As及其宿主RNA;低下，降低两个 m 的水平6S2 PDAC与S1 PDAC中的As及其宿主RNA水平;低上，m 降低6与S1 PDAC相比，S2 PDAC中的RNA水平有所增加;变化不显著，S2 PDAC与S1 PDAC的RNA水平没有显著变化。
b PANC-1 细胞中 CSTF2 敲低时差异表达的 CSTF2 靶 RNA 的瀑布图。
c 基于 dCas13 的 m 示意图6编辑系统。
d 相对 m6转染 dCas13b-ALKBH5 和非靶标 gRNA 或靶向 m 后，MeRIP-qPCR 检测到的 CENPF、WNT7B、NTSR1 转录本富集6分别是特定 RNA 的 A。
e 转染 dCas13b-ALKBH5 和非靶标 gRNA 或靶向 gRNA 时，CLIP-qPCR 检测到的指示转录本的相对IGF2BP2富集 m6分别为特异性 RNA 的 A。
f， g 转染 dCas13b-ALKBH5 和非靶标 gRNA 或靶向 gRNA 时，qRT-PCR 检测到的 CENPF、WNT7B、NTSR1 的相对 mRNA 水平 （f） 和半衰期 （g） m6分别表示 RNA 的 A。
h， i 操作 m 时 qRT-PCR 检测到的 CENPF、WNT7B、NTSR1 的相对 mRNA 水平 （h） 和半衰期 （i）6基于 dCas13 的站点 m6带或不带强制表达IGF2BP2的救援编辑系统。数据是 d−i 中三个独立实验的平均 ± S.E.M.。
02
研究结论
总之，我们已经全面破译了转录组范围的m6PDAC中的mRNA修饰。我们已经确定 CSTF2 促进 m6mRNA的修饰和IGF2BP2增强了mRNA的稳定性，并具有高甲基化的m。6As，形成 CSTF2-m6A-IGF2BP2轴（图1）。7）.这个m的异常6修饰相关轴可能有助于PDAC的发展和进展，因此在PDAC精准医疗中具有潜在的临床应用。
好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理. 数据分析等支持.也随时可以联系我们。
