大家好，今天给大家分享2024年1月9日，马凤霞副研究员与哈佛大学医学院罗鸿博教授合作在Nature Commu nications在线发布了题为“Gasdermin E dictates inflam matory respon ses by controlling the mode of neutr ophil death”的研究论文，该研究文章主要探讨了中性粒细胞Gasdermin E (GSDME)如何通过控制中性粒细胞死亡方式来调控炎症反应。
01
研究背景
裂解细胞和凋亡细胞死亡都会去除生物体中的衰老和受损细胞。然而，它们分别引起对比鲜明的促炎和抗炎反应。控制这两种死亡模式之间选择的精确细胞机制仍不完全清楚。在这里，我们将 Gasdermin E （GSDME） 确定为中性粒细胞溶解性热沉死的主开关。
衰老中性粒细胞中严格调节的 GSDME 切割和激活由蛋白酶-3 和半胱天冬酶-3 介导，导致细胞焦亡。GSDME缺乏不会改变中性粒细胞总生存率;相反，它特异性地排除了细胞焦亡，并使中性粒细胞死亡偏向于细胞凋亡，从而减轻了由于巨噬细胞增强凋亡中性粒细胞的胞吐作用而引起的炎症反应。
在临床相关的酸吸入诱导的肺损伤模型中，中性粒细胞特异性 GSDME 缺失可减少肺部炎症，促进炎症消退并减轻肺损伤。
见图一
GSDME破坏消除了中性粒细胞溶解性死亡，而不影响中性粒细胞的总体存活率。
图一
a 中性粒细胞自发死亡期间GSDME的裂解。使用来自WT小鼠的骨髓来源的中性粒细胞。结果至少代表了三个生物学重复。所有数据均表示为平均值± SD，n = 3 个独立重复。
b 中性粒细胞凋亡和裂解细胞死亡的代表性图像。结果至少代表了三个独立的实验。
c 指定时间点老化中性粒细胞的代表性图像。白色箭头表示肿胀或“膨胀”的细胞（溶解性细胞死亡）。PI碘化丙啶，BF明场。结果至少代表了三个独立的实验。
d 肿胀、房室阳性和 PI 阳性细胞的百分比和数量。±n = 4 个独立重复，*P < 0.05，**P < 0.01，ns 不显著（AV 细胞百分比：4 小时，P = 0.0273;8 小时，P = 0.0285;12 小时，P = 0.0011;16 小时，P = 0.001;20 小时，P = 0.0004;24 小时，P = 0.0067。PI细胞百分比：8小时，P = 0.0297;12 小时，P = 0.0011;16 小时，P = 0.022;20 h， P = 0.0168;24 小时，P = 0.0037。房室细胞数：4 h，P = 0.0184;8 小时，P = 0.0261;12 小时，P = 0.0001;16 小时，P = 0.0001;20 小时，P = 0.0001;24 小时，P = 0.0001。PI细胞数：8 h，P=0.0046;12 小时，P = 0.0099;24 h，P = 0.0012）。
e 剩余的完整中性粒细胞数目。±n = 3 个独立重复，*P < 0.05，**P < 0.01（剩余单元数：12 小时，P = 0.0119;16 小时，P = 0.024;20 小时，P = 0.0001;24 小时，P = 0.0001;24 小时，P = 0.0001。消失的细胞数：12 h，P = 0.0132;16 h， P = 0.0207;20 小时，P = 0.0247）。
f 健康中性粒细胞的百分比和数量。±n = 4 次独立重复，*P < 0.05，**P < 0.01，ns 不显著（健康细胞百分比：8 小时，P = 0.0499;12 小时，P = 0.0115;16 小时，P = 0.0001;20 小时，P = 0.0005;24 小时，P = 0.0008）。
g 健康中性粒细胞和经历细胞凋亡或裂解性细胞死亡的中性粒细胞的绝对数量。所有数据均表示为平均值± SD（n = 4 个独立重复）。
h LDH从细胞培养上清液中释放。±n = 3 个独立重复，*P < 0.05，**P < 0.01（4 小时，P = 0.042;8 小时，P = 0.0001;12 小时，P = 0.0003;16 小时，P = 0.0023）。通过未配对的双侧学生 t 检验 （d， e， f， h） 检查统计学显着性。
见图二
GSDME破坏使程序性中性粒细胞死亡与细胞凋亡呈偏差。
图二
a 经历自发性细胞死亡的中性粒细胞的代表性流式细胞术图。结果至少代表了三个生物学重复。
b AV的百分比−圆周率−、AVPI+−和 AVPI 单元格在指定的时间点。±n = 3 个独立重复，*P < 0.05，**P < 0.01，ns 通过未配对的双侧学生 t 检验不显著（AV 百分比++−圆周率−细胞：8 h，P = 0.0082;12 h， P = 0.0279;16 小时，P = 0.0083;20 h， P = 0.001;24 小时，P = 0.0288。AVPI 的百分比+−细胞：4 h，P = 0.0064;8 h， P = 0.0049;12 小时，P = 0.0022;16 小时，P = 0.0007。AVPI细胞百分比：4小时，P = 0.0048;8 h，P = 0.001）。
c AV数量++−圆周率−、AVPI+−和 AVPI 单元格在指定的时间点。所有数据均表示为平均值± SD。n = 3 个独立重复，*P < 0.05，**P < 0.01，ns 通过未配对的双侧学生 t 检验（AVPI 的数量+++−细胞：4 h，P = 0.0001;8 小时，P = 0.0006;12 小时，P = 0.0004;16 h， P = 0.0024;20 小时，P = 0.0059;24 小时，P = 0.0455。AVPI细胞数：4 h，P = 0.0017;8 小时，P = 0.0001;16 h， P = 0.0335;20 h，P = 0.0008）。
d 培养8 h的WT和Gsdme KO中性粒细胞散点图上不同群体的代表性散点图和AV/PI染色。结果至少代表了三个生物学重复。
e 中性粒细胞自发死亡期间的 Caspase-3 裂解。蛋白质印迹结果至少代表了三个独立的实验。使用 NIH ImageJ 软件通过密度分析定量裂解的 caspase-3 的相对量。结果是三个独立实验的平均值 （±SD）。*P < 0.05，**P < 0.01 与 WT 中性粒细胞的双侧学生检验（4 小时，P = 0.0168;8 小时，P = 0.0032;12 小时，P = 0.0010;16 小时，P = 0.039）。
f 中性粒细胞自发死亡期间 PARP1 的切割。蛋白质印迹结果至少代表了三个独立的实验。基于密度测定法定量切割的 PARP1 的相对量。结果是三个独立实验的平均值 （±SD）。*P < 0.05，**P < 0.01 与 WT 中性粒细胞的双侧学生 t 检验（8 小时，P = 0.386;12 小时，P = 0.004;16 小时，P = 0.0319）。
g WT 和 Gsdme KO 中性粒细胞程序性自发死亡模式的总结。
见图三
程序性自发性中性粒细胞死亡过程中的GSDME切割由PR3和caspase-3介导。
图三
A 用半胱天冬酶抑制剂治疗的中性粒细胞中的 GSDME 裂解。用泛半胱天冬酶 （QVD-OPH 100 μM）、半胱天冬酶-3 （Z-DEVD-FMK 100 μM）、半胱天冬酶-1 （VX765 25 μM）、半胱天冬酶-8 （Z-IETD-FMK 10 μM） 或半胱天冬酶-9 （Z-LEHD-FMK 20 μM） 抑制剂处理来自 WT 小鼠骨髓的中性粒细胞 16 小时。β-肌动蛋白用作蛋白上样对照。结果代表了三个生物学重复。基于密度测定法对裂解的GSDME-NT的相对水平进行定量。结果是平均值 （±SD）。n = 4 个独立重复。**P < 0.01 与 DMSO 处理的中性粒细胞相比，通过双侧学生 t 检验 （QVD-OPH，P = 0.0001; Z-DEVD-FMK，P = 0.0029）。
b 用丝氨酸蛋白酶抑制剂氟磷酸二异丙酯（DFP）处理的中性粒细胞中的GSDME裂解。中性粒细胞用丝氨酸蛋白酶DFP（100μM）或Z-DEVD-FMK（作为阳性对照）处理6小时。图中显示了三个独立实验的代表性免疫印迹。密度测定结果是三个独立实验的平均值 （±SD）。*P < 0.05 与 DMSO 处理的中性粒细胞相比，通过双侧学生 t 检验（DFP，P = 0.022; Z-DEVD-FMK，P = 0.0211）。
c 丝氨酸蛋白酶和半胱天冬酶-3 对 GSDME 的切割。小鼠GSDME在HEK293T细胞中过表达。将细胞裂解物与指定的蛋白酶或 caspase-3 孵育 1 小时，通过免疫印迹评估 GSDME 裂解。UT 未处理、EL 弹性蛋白酶、CG 组织蛋白酶 G、PR3 蛋白酶 3。结果代表了三个独立的实验。
d 程序性自发性中性粒细胞死亡期间GSDME切割的总结。在衰老的中性粒细胞中，PR3 从颗粒中释放出来，导致 procaspase-3 的切割和激活。活性半胱天冬酶-3 反过来裂解 GSDME 以产生 GSDME-NT，其靶向质膜以诱导膜孔形成和裂解细胞死亡。
e 炎症期间中性粒细胞中的GSDME切割。用热灭活的大肠杆菌攻击小鼠。（HIEC，107cfu） 表示的时间段。如上所述，通过蛋白质印迹法评估纯化中性粒细胞中的GSDME裂解。图中显示了三个独立实验的代表性免疫印迹。密度测定结果是三个独立实验的平均值 （±SD）。
见图四
中性粒细胞GSDME的遗传消融增强了腹膜炎中的胞吐作用。
图四
a 评估腹膜炎中体外老化中性粒细胞胞外作用的实验方案。将来自WT和Gsdme KO小鼠的中性粒细胞培养20小时，并用1μM CFSE染色10分钟。将CFSE标记的老年中性粒细胞腹膜内注射到用热灭活大肠杆菌攻击的受体小鼠中。（HIEC，107cfu）在过继转移后48小时1小时，灌洗腹膜腔以收集细胞以评估巨噬细胞对CFSE中性粒细胞的吞噬。
b 通过流式细胞术评估被巨噬细胞吞噬的过继转移中性粒细胞的百分比。被吞噬后，过继转移的中性粒细胞变为 ly6g 阴性，但仍为 CFSE 阳性。所有数据均表示为SD±平均值，n = 4只小鼠，**P<0.01（P = 0.0001）。
c 通过流式细胞术评估吞噬至少一种凋亡中性粒细胞的巨噬细胞百分比。在腹膜腔中，F4/80CD11bLy6c+++−巨噬细胞可以吞噬凋亡的中性粒细胞。在吞噬过继转移的中性粒细胞后，巨噬细胞变为 CFSE 阳性。所有数据均表示为SD±平均值，n = 3只小鼠，*P<0.05（P = 0.0126）。
d 评估腹膜炎中体内老化中性粒细胞胞吐作用的实验方案。用 1 μM CFSE 染色 10 分钟，将来自 WT 和 Gsdme KO 小鼠的新鲜中性粒细胞腹膜内注射到用 HIEC 攻击的受体小鼠中 48 小时。过继转移后 6 小时，灌洗腹膜腔以收集细胞以评估巨噬细胞对 CFSE 中性粒细胞的吞噬。
e 通过流式细胞术评估被巨噬细胞吞噬的过继转移中性粒细胞的百分比。所有数据均表示为SD±平均值，n = 7-8只小鼠，*P<0.05（P = 0.0293）。
f 通过流式细胞术评估吞噬至少一个凋亡中性粒细胞的巨噬细胞百分比。所有数据均表示为SD±平均值，n = 4只小鼠;**P < 0.01 （P = 0.0002）。
见图五
中性粒细胞GSDME的基因消融抑制了腹膜炎的炎症反应。
图五
a 显示评估 WT 和 Gsdme 全身 KO 小鼠在腹膜炎期间炎症反应的实验设计示意图。
b 腹膜灌洗液中的IL-10和IL-1β水平。所有数据均表示为平均±SD，n = 5 只小鼠，*P < 0.05，**P < 0.01（IL-10，P = 0.030 ;IL-1β，P=0.0004）。
c 腹膜腔中性粒细胞百分比和数量。所有数据均表示为平均±SD，n = 7-8 只小鼠，**P < 0.01（中性粒细胞百分比，P = 0.0048;中性粒细胞数，P=0.004）。
d 评估WT（Mrp8-cre（-）/Gsdme炎症反应的实验设计示意图FL/FL)和中性粒细胞特异性条件性 Gsdme KO （Mrp8-cre（+）/GsdmeΔ/Δ）腹膜炎期间的小鼠。
e 体内中性粒细胞死亡。腹膜腔的灌洗液直接用APC-Ly6g染色以标记中性粒细胞，并用膜联蛋白V（AV）和SYTOX Orange标记死细胞，所有这些都无需离心。这些牢房随后被固定并立即拍照。这些图像代表了至少三个独立的实验。蓝色箭头表示溶解性死亡中性粒细胞，白色箭头表示凋亡中性粒细胞。比例尺代表 10 μm。数据以 SD ±平均值表示，n = 3–4 个独立重复。
f 腹膜灌洗液中的IL-10和IL-1β水平。所有数据均表示为平均±SD，n = 6只小鼠，*P<0.05，**P<0.01（IL-10，P = 0.0108; IL-1β，P=0.0001）。
g 腹膜腔中嗜中性粒细胞的百分比和数量。所有数据均表示为平均±SD，n = 5-6 只小鼠，*P < 0.05（中性粒细胞百分比，P = 0.0299;中性粒细胞数，P=0.0452）。
h 腹膜灌洗液中的总蛋白水平。所有数据均表示为SD±平均值，n = 4-5只小鼠，*P<0.05（P = 0.0308）。
i 腹膜灌洗液中的 MPO 水平。所有数据均表示为SD±平均值，n = 4-5只小鼠，*P<0.05（P = 0.0368）。
见图六
中性粒细胞中GSDME的破坏减轻了LPS诱导的肺炎期间的炎症并减轻了肺损伤。
图六
a LPS诱发的急性肺损伤实验设计示意图。
b BALF中总白细胞和中性粒细胞的定量。所有数据均表示为平均±SD，n = 4-5 只小鼠/组，*P < 0.05 （WBC，P = 0.0247; 中性粒细胞，P = 0.0194）。
c BALF中的总蛋白。数据表示为SD±平均值，n = 4只小鼠/组，*P<0.05（P=0.0350）。
d BALF中的LDH释放。数据表示为平均值± SD，n = 3–4/组，*P < 0.05 （P = 0.0201）。
e BALF中的IL-6和IL-1β水平。数据表示为平均±SD，n = 4 只小鼠/组，*P < 0.05，**P < 0.01（IL-6，P = 0.0309 ;IL-1β，P=0.0033）。
f 苏木精和伊红 （H&E） 肺切片染色。结果代表了三个生物学重复。
g 肺部炎症和损伤评估为中性粒细胞募集（肺泡的体积百分比）和肺部水肿面积。数据表示为平均± SD，n = 4-5 只小鼠/组，**P < 0.01（招募的中性粒细胞，P = 0.0072;水肿面积占总面积的比重，P=0.0058）。
h 评估 LPS 诱导的 WT 和中性粒细胞特异性 Gsdme 条件 KO 小鼠肺部炎症和相关肺损伤的实验方案。
i BALF中总白细胞和中性粒细胞的定量。数据表示为平均±SD，n = 4-5 只小鼠/组，*P < 0.05 （WBC，P = 0.0238; 中性粒细胞，P=0.0276）。
j BALF中的总蛋白。数据表示为平均值±SD，n = 3-4 只小鼠/组，*P < 0.05 （P = 0.0214）。
k BALF中的LDH释放。数据表示为平均值±SD，n = 3-4 只小鼠/组，*P < 0.05 （P = 0.0487）。
l BALF中的IL-6和IL-1β水平。数据表示为平均±SD，n = 3-4 只小鼠/组，*P < 0.05，**P < 0.01 （IL-6，P = 0.0123 ;IL-1β，P=0.0074）。 肺切片的 m H&E 染色。结果代表了三个生物学重复。n 肺部炎症和组织损伤测量为中性粒细胞募集和肺部水肿面积。数据表示为平均值±SD，n = 3 只小鼠/组，**P < 0.01 （P = 0.0001）。
见图七
中性粒细胞中的GSDME破坏增强了发炎肺部的胞吐作用。
图七
a 评估LPS诱导的急性肺损伤中体外老化中性粒细胞胞吐作用的实验方案。将来自WT和Gsdme KO小鼠的BM中性粒细胞培养20小时，并用1μM CFSE染色10分钟。将CFSE标记的老年中性粒细胞气管内注射到用5mg / kg LPS攻击的受体小鼠中。过继转移后 1 小时，灌洗肺以收集细胞以评估巨噬细胞对 CFSE 中性粒细胞的吞噬。
b 通过流式细胞术评估吞噬至少一个凋亡中性粒细胞的巨噬细胞的百分比，如图所示。4. 流式细胞术图像至少代表了三个独立实验。所有数据均表示为平均值±SD，n = 6 只小鼠，**P < 0.01 通过双侧学生 t 检验 （P = 0.0021）。
c 通过流式细胞术评估被巨噬细胞吞噬的过继转移的中性粒细胞的百分比，如图所示。4. 流式细胞术图像至少代表了三个独立实验。所有数据均表示为平均值± SD，n = 4 只小鼠，**P < 0.01 通过双侧学生 t 检验 （P = 0.0077）。
d 评估LPS诱导的急性肺损伤中体内老化中性粒细胞胞吐作用的实验方案。用CFSE染色来自WT和Gsdme KO小鼠的新鲜中性粒细胞。将CFSE标记的新鲜中性粒细胞气管内注射到用LPS攻击的受体小鼠中。过继转移后 6 小时，灌洗肺以收集细胞以评估巨噬细胞对 CFSE 中性粒细胞的吞噬。
e 通过流式细胞术评估吞噬至少一个凋亡中性粒细胞的巨噬细胞的百分比。流式细胞术图片代表了至少三个独立的实验。所有数据均表示为SD±均值，n = 5只小鼠;**P < 0.01 通过双侧学生 t 检验 （P = 0.0035）。
f 通过流式细胞术评估被巨噬细胞吞噬的过继转移中性粒细胞的百分比。流式细胞术图片代表了至少三个独立的实验。
见图八
在金黄色葡萄球菌诱导的肺炎期间，中性粒细胞中的GSDME破坏减轻了炎症。
图八
a 估金黄色葡萄球菌诱导的 WT 和中性粒细胞特异性 Gsdme 条件 KO 小鼠肺炎症和相关肺损伤的实验方案。中性粒细胞特异性 Gsdme 条件性 KO （Mrp8-cre（+）/Gsdme 诱导肺炎Δ/Δ）和他们的WT（Mrp8-cre（-）/GsdmeFL/FL） 使用金黄色葡萄球菌的同窝仔猪。在感染后的不同时间点评估中性粒细胞募集、肺部炎症和肺损伤。
b 来自Mrp8-cre（-）/Gsdme的BALF中总白细胞和中性粒细胞的定量FL/FL和 Mrp8-cre（+）/GsdmeΔ/Δ小鼠在指定时间点诱导肺炎后。数据表示为SEM的平均值±（n = 4-6只小鼠/组）。*P < 0.05，**P < 0.01 通过双侧学生 t 检验（WBC：24 小时，P = 0.0115;48 小时，P = 0.0125。中性粒细胞：24 h，P = 0.0107;48 h，P = 0.0058）。
c 感染金黄色葡萄球菌的小鼠 BALF 中的 IL-1β、IL-1 和 IL-10 水平。数据显示为SEM±平均值（n = 4-6只小鼠/组）。*P < 0.05。ND检测不到（IL-10，P =0.0221。IL-1β：24 h，P = 0.0118;48 小时，P = 0.0140。IL-6：24 h，P = 0.0081;48 小时，P = 0.0435）。
d 感染后 BALF 的 LDH 释放。数据表示为平均± SEM（n = 4-6 只小鼠/组）。*P < 0.05 通过双侧学生 t 检验（24 小时，P = 0.0049;48 小时，P = 0.0215）。
e BALF中的总蛋白质浓度。数据显示为平均± SEM （n = 4–6 只小鼠/组）。*P < 0.05 通过双侧学生 t 检验（24 小时，P = 0.009;48 小时，P = 0.0453）。
f Mrp8-cre（-）/Gsdme 肺部的细菌负荷FL/FL和 Mrp8-cre（+）/GsdmeΔ/Δ在指定的时间点感染金黄色葡萄球菌后的小鼠。数据表示为平均± SEM（n = 4-6 只小鼠/组）。**P < 0.01。NS 在双侧学生 t 检验中不显著 （P = 0.0035）。
g Mrp8-cre（-）/Gsdme 的 BALF 中的细菌计数FL/FL和 Mrp8-cre（+）/GsdmeΔ/Δ在指定的时间点感染金黄色葡萄球菌后的小鼠。数据以平均±SEM表示（n = 4-6/小鼠组）。P<0.001。NS 在双侧学生 t 检验中不显著 （P = 0.0007）。
02
研究结论
在这里，我们发现了GSDME在解决炎症方面的重要功能。通过决定中性粒细胞死亡的模式，GSDME可以作为治疗靶点来调节宿主防御和炎症。
因此，通过控制中性粒细胞死亡模式，GSDME决定了宿主的炎症结果，为感染性和炎症性疾病提供了潜在的治疗靶点。
好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理. 数据分析等支持.也随时可以联系我们。
01
研究背景
裂解细胞和凋亡细胞死亡都会去除生物体中的衰老和受损细胞。然而，它们分别引起对比鲜明的促炎和抗炎反应。控制这两种死亡模式之间选择的精确细胞机制仍不完全清楚。在这里，我们将 Gasdermin E （GSDME） 确定为中性粒细胞溶解性热沉死的主开关。
衰老中性粒细胞中严格调节的 GSDME 切割和激活由蛋白酶-3 和半胱天冬酶-3 介导，导致细胞焦亡。GSDME缺乏不会改变中性粒细胞总生存率;相反，它特异性地排除了细胞焦亡，并使中性粒细胞死亡偏向于细胞凋亡，从而减轻了由于巨噬细胞增强凋亡中性粒细胞的胞吐作用而引起的炎症反应。
在临床相关的酸吸入诱导的肺损伤模型中，中性粒细胞特异性 GSDME 缺失可减少肺部炎症，促进炎症消退并减轻肺损伤。
见图一
GSDME破坏消除了中性粒细胞溶解性死亡，而不影响中性粒细胞的总体存活率。
图一
a 中性粒细胞自发死亡期间GSDME的裂解。使用来自WT小鼠的骨髓来源的中性粒细胞。结果至少代表了三个生物学重复。所有数据均表示为平均值± SD，n = 3 个独立重复。
b 中性粒细胞凋亡和裂解细胞死亡的代表性图像。结果至少代表了三个独立的实验。
c 指定时间点老化中性粒细胞的代表性图像。白色箭头表示肿胀或“膨胀”的细胞（溶解性细胞死亡）。PI碘化丙啶，BF明场。结果至少代表了三个独立的实验。
d 肿胀、房室阳性和 PI 阳性细胞的百分比和数量。±n = 4 个独立重复，*P < 0.05，**P < 0.01，ns 不显著（AV 细胞百分比：4 小时，P = 0.0273;8 小时，P = 0.0285;12 小时，P = 0.0011;16 小时，P = 0.001;20 小时，P = 0.0004;24 小时，P = 0.0067。PI细胞百分比：8小时，P = 0.0297;12 小时，P = 0.0011;16 小时，P = 0.022;20 h， P = 0.0168;24 小时，P = 0.0037。房室细胞数：4 h，P = 0.0184;8 小时，P = 0.0261;12 小时，P = 0.0001;16 小时，P = 0.0001;20 小时，P = 0.0001;24 小时，P = 0.0001。PI细胞数：8 h，P=0.0046;12 小时，P = 0.0099;24 h，P = 0.0012）。
e 剩余的完整中性粒细胞数目。±n = 3 个独立重复，*P < 0.05，**P < 0.01（剩余单元数：12 小时，P = 0.0119;16 小时，P = 0.024;20 小时，P = 0.0001;24 小时，P = 0.0001;24 小时，P = 0.0001。消失的细胞数：12 h，P = 0.0132;16 h， P = 0.0207;20 小时，P = 0.0247）。
f 健康中性粒细胞的百分比和数量。±n = 4 次独立重复，*P < 0.05，**P < 0.01，ns 不显著（健康细胞百分比：8 小时，P = 0.0499;12 小时，P = 0.0115;16 小时，P = 0.0001;20 小时，P = 0.0005;24 小时，P = 0.0008）。
g 健康中性粒细胞和经历细胞凋亡或裂解性细胞死亡的中性粒细胞的绝对数量。所有数据均表示为平均值± SD（n = 4 个独立重复）。
h LDH从细胞培养上清液中释放。±n = 3 个独立重复，*P < 0.05，**P < 0.01（4 小时，P = 0.042;8 小时，P = 0.0001;12 小时，P = 0.0003;16 小时，P = 0.0023）。通过未配对的双侧学生 t 检验 （d， e， f， h） 检查统计学显着性。
见图二
GSDME破坏使程序性中性粒细胞死亡与细胞凋亡呈偏差。
图二
a 经历自发性细胞死亡的中性粒细胞的代表性流式细胞术图。结果至少代表了三个生物学重复。
b AV的百分比−圆周率−、AVPI+−和 AVPI 单元格在指定的时间点。±n = 3 个独立重复，*P < 0.05，**P < 0.01，ns 通过未配对的双侧学生 t 检验不显著（AV 百分比++−圆周率−细胞：8 h，P = 0.0082;12 h， P = 0.0279;16 小时，P = 0.0083;20 h， P = 0.001;24 小时，P = 0.0288。AVPI 的百分比+−细胞：4 h，P = 0.0064;8 h， P = 0.0049;12 小时，P = 0.0022;16 小时，P = 0.0007。AVPI细胞百分比：4小时，P = 0.0048;8 h，P = 0.001）。
c AV数量++−圆周率−、AVPI+−和 AVPI 单元格在指定的时间点。所有数据均表示为平均值± SD。n = 3 个独立重复，*P < 0.05，**P < 0.01，ns 通过未配对的双侧学生 t 检验（AVPI 的数量+++−细胞：4 h，P = 0.0001;8 小时，P = 0.0006;12 小时，P = 0.0004;16 h， P = 0.0024;20 小时，P = 0.0059;24 小时，P = 0.0455。AVPI细胞数：4 h，P = 0.0017;8 小时，P = 0.0001;16 h， P = 0.0335;20 h，P = 0.0008）。
d 培养8 h的WT和Gsdme KO中性粒细胞散点图上不同群体的代表性散点图和AV/PI染色。结果至少代表了三个生物学重复。
e 中性粒细胞自发死亡期间的 Caspase-3 裂解。蛋白质印迹结果至少代表了三个独立的实验。使用 NIH ImageJ 软件通过密度分析定量裂解的 caspase-3 的相对量。结果是三个独立实验的平均值 （±SD）。*P < 0.05，**P < 0.01 与 WT 中性粒细胞的双侧学生检验（4 小时，P = 0.0168;8 小时，P = 0.0032;12 小时，P = 0.0010;16 小时，P = 0.039）。
f 中性粒细胞自发死亡期间 PARP1 的切割。蛋白质印迹结果至少代表了三个独立的实验。基于密度测定法定量切割的 PARP1 的相对量。结果是三个独立实验的平均值 （±SD）。*P < 0.05，**P < 0.01 与 WT 中性粒细胞的双侧学生 t 检验（8 小时，P = 0.386;12 小时，P = 0.004;16 小时，P = 0.0319）。
g WT 和 Gsdme KO 中性粒细胞程序性自发死亡模式的总结。
见图三
程序性自发性中性粒细胞死亡过程中的GSDME切割由PR3和caspase-3介导。
图三
A 用半胱天冬酶抑制剂治疗的中性粒细胞中的 GSDME 裂解。用泛半胱天冬酶 （QVD-OPH 100 μM）、半胱天冬酶-3 （Z-DEVD-FMK 100 μM）、半胱天冬酶-1 （VX765 25 μM）、半胱天冬酶-8 （Z-IETD-FMK 10 μM） 或半胱天冬酶-9 （Z-LEHD-FMK 20 μM） 抑制剂处理来自 WT 小鼠骨髓的中性粒细胞 16 小时。β-肌动蛋白用作蛋白上样对照。结果代表了三个生物学重复。基于密度测定法对裂解的GSDME-NT的相对水平进行定量。结果是平均值 （±SD）。n = 4 个独立重复。**P < 0.01 与 DMSO 处理的中性粒细胞相比，通过双侧学生 t 检验 （QVD-OPH，P = 0.0001; Z-DEVD-FMK，P = 0.0029）。
b 用丝氨酸蛋白酶抑制剂氟磷酸二异丙酯（DFP）处理的中性粒细胞中的GSDME裂解。中性粒细胞用丝氨酸蛋白酶DFP（100μM）或Z-DEVD-FMK（作为阳性对照）处理6小时。图中显示了三个独立实验的代表性免疫印迹。密度测定结果是三个独立实验的平均值 （±SD）。*P < 0.05 与 DMSO 处理的中性粒细胞相比，通过双侧学生 t 检验（DFP，P = 0.022; Z-DEVD-FMK，P = 0.0211）。
c 丝氨酸蛋白酶和半胱天冬酶-3 对 GSDME 的切割。小鼠GSDME在HEK293T细胞中过表达。将细胞裂解物与指定的蛋白酶或 caspase-3 孵育 1 小时，通过免疫印迹评估 GSDME 裂解。UT 未处理、EL 弹性蛋白酶、CG 组织蛋白酶 G、PR3 蛋白酶 3。结果代表了三个独立的实验。
d 程序性自发性中性粒细胞死亡期间GSDME切割的总结。在衰老的中性粒细胞中，PR3 从颗粒中释放出来，导致 procaspase-3 的切割和激活。活性半胱天冬酶-3 反过来裂解 GSDME 以产生 GSDME-NT，其靶向质膜以诱导膜孔形成和裂解细胞死亡。
e 炎症期间中性粒细胞中的GSDME切割。用热灭活的大肠杆菌攻击小鼠。（HIEC，107cfu） 表示的时间段。如上所述，通过蛋白质印迹法评估纯化中性粒细胞中的GSDME裂解。图中显示了三个独立实验的代表性免疫印迹。密度测定结果是三个独立实验的平均值 （±SD）。
见图四
中性粒细胞GSDME的遗传消融增强了腹膜炎中的胞吐作用。
图四
a 评估腹膜炎中体外老化中性粒细胞胞外作用的实验方案。将来自WT和Gsdme KO小鼠的中性粒细胞培养20小时，并用1μM CFSE染色10分钟。将CFSE标记的老年中性粒细胞腹膜内注射到用热灭活大肠杆菌攻击的受体小鼠中。（HIEC，107cfu）在过继转移后48小时1小时，灌洗腹膜腔以收集细胞以评估巨噬细胞对CFSE中性粒细胞的吞噬。
b 通过流式细胞术评估被巨噬细胞吞噬的过继转移中性粒细胞的百分比。被吞噬后，过继转移的中性粒细胞变为 ly6g 阴性，但仍为 CFSE 阳性。所有数据均表示为SD±平均值，n = 4只小鼠，**P<0.01（P = 0.0001）。
c 通过流式细胞术评估吞噬至少一种凋亡中性粒细胞的巨噬细胞百分比。在腹膜腔中，F4/80CD11bLy6c+++−巨噬细胞可以吞噬凋亡的中性粒细胞。在吞噬过继转移的中性粒细胞后，巨噬细胞变为 CFSE 阳性。所有数据均表示为SD±平均值，n = 3只小鼠，*P<0.05（P = 0.0126）。
d 评估腹膜炎中体内老化中性粒细胞胞吐作用的实验方案。用 1 μM CFSE 染色 10 分钟，将来自 WT 和 Gsdme KO 小鼠的新鲜中性粒细胞腹膜内注射到用 HIEC 攻击的受体小鼠中 48 小时。过继转移后 6 小时，灌洗腹膜腔以收集细胞以评估巨噬细胞对 CFSE 中性粒细胞的吞噬。
e 通过流式细胞术评估被巨噬细胞吞噬的过继转移中性粒细胞的百分比。所有数据均表示为SD±平均值，n = 7-8只小鼠，*P<0.05（P = 0.0293）。
f 通过流式细胞术评估吞噬至少一个凋亡中性粒细胞的巨噬细胞百分比。所有数据均表示为SD±平均值，n = 4只小鼠;**P < 0.01 （P = 0.0002）。
见图五
中性粒细胞GSDME的基因消融抑制了腹膜炎的炎症反应。
图五
a 显示评估 WT 和 Gsdme 全身 KO 小鼠在腹膜炎期间炎症反应的实验设计示意图。
b 腹膜灌洗液中的IL-10和IL-1β水平。所有数据均表示为平均±SD，n = 5 只小鼠，*P < 0.05，**P < 0.01（IL-10，P = 0.030 ;IL-1β，P=0.0004）。
c 腹膜腔中性粒细胞百分比和数量。所有数据均表示为平均±SD，n = 7-8 只小鼠，**P < 0.01（中性粒细胞百分比，P = 0.0048;中性粒细胞数，P=0.004）。
d 评估WT（Mrp8-cre（-）/Gsdme炎症反应的实验设计示意图FL/FL)和中性粒细胞特异性条件性 Gsdme KO （Mrp8-cre（+）/GsdmeΔ/Δ）腹膜炎期间的小鼠。
e 体内中性粒细胞死亡。腹膜腔的灌洗液直接用APC-Ly6g染色以标记中性粒细胞，并用膜联蛋白V（AV）和SYTOX Orange标记死细胞，所有这些都无需离心。这些牢房随后被固定并立即拍照。这些图像代表了至少三个独立的实验。蓝色箭头表示溶解性死亡中性粒细胞，白色箭头表示凋亡中性粒细胞。比例尺代表 10 μm。数据以 SD ±平均值表示，n = 3–4 个独立重复。
f 腹膜灌洗液中的IL-10和IL-1β水平。所有数据均表示为平均±SD，n = 6只小鼠，*P<0.05，**P<0.01（IL-10，P = 0.0108; IL-1β，P=0.0001）。
g 腹膜腔中嗜中性粒细胞的百分比和数量。所有数据均表示为平均±SD，n = 5-6 只小鼠，*P < 0.05（中性粒细胞百分比，P = 0.0299;中性粒细胞数，P=0.0452）。
h 腹膜灌洗液中的总蛋白水平。所有数据均表示为SD±平均值，n = 4-5只小鼠，*P<0.05（P = 0.0308）。
i 腹膜灌洗液中的 MPO 水平。所有数据均表示为SD±平均值，n = 4-5只小鼠，*P<0.05（P = 0.0368）。
见图六
中性粒细胞中GSDME的破坏减轻了LPS诱导的肺炎期间的炎症并减轻了肺损伤。
图六
a LPS诱发的急性肺损伤实验设计示意图。
b BALF中总白细胞和中性粒细胞的定量。所有数据均表示为平均±SD，n = 4-5 只小鼠/组，*P < 0.05 （WBC，P = 0.0247; 中性粒细胞，P = 0.0194）。
c BALF中的总蛋白。数据表示为SD±平均值，n = 4只小鼠/组，*P<0.05（P=0.0350）。
d BALF中的LDH释放。数据表示为平均值± SD，n = 3–4/组，*P < 0.05 （P = 0.0201）。
e BALF中的IL-6和IL-1β水平。数据表示为平均±SD，n = 4 只小鼠/组，*P < 0.05，**P < 0.01（IL-6，P = 0.0309 ;IL-1β，P=0.0033）。
f 苏木精和伊红 （H&E） 肺切片染色。结果代表了三个生物学重复。
g 肺部炎症和损伤评估为中性粒细胞募集（肺泡的体积百分比）和肺部水肿面积。数据表示为平均± SD，n = 4-5 只小鼠/组，**P < 0.01（招募的中性粒细胞，P = 0.0072;水肿面积占总面积的比重，P=0.0058）。
h 评估 LPS 诱导的 WT 和中性粒细胞特异性 Gsdme 条件 KO 小鼠肺部炎症和相关肺损伤的实验方案。
i BALF中总白细胞和中性粒细胞的定量。数据表示为平均±SD，n = 4-5 只小鼠/组，*P < 0.05 （WBC，P = 0.0238; 中性粒细胞，P=0.0276）。
j BALF中的总蛋白。数据表示为平均值±SD，n = 3-4 只小鼠/组，*P < 0.05 （P = 0.0214）。
k BALF中的LDH释放。数据表示为平均值±SD，n = 3-4 只小鼠/组，*P < 0.05 （P = 0.0487）。
l BALF中的IL-6和IL-1β水平。数据表示为平均±SD，n = 3-4 只小鼠/组，*P < 0.05，**P < 0.01 （IL-6，P = 0.0123 ;IL-1β，P=0.0074）。 肺切片的 m H&E 染色。结果代表了三个生物学重复。n 肺部炎症和组织损伤测量为中性粒细胞募集和肺部水肿面积。数据表示为平均值±SD，n = 3 只小鼠/组，**P < 0.01 （P = 0.0001）。
见图七
中性粒细胞中的GSDME破坏增强了发炎肺部的胞吐作用。
图七
a 评估LPS诱导的急性肺损伤中体外老化中性粒细胞胞吐作用的实验方案。将来自WT和Gsdme KO小鼠的BM中性粒细胞培养20小时，并用1μM CFSE染色10分钟。将CFSE标记的老年中性粒细胞气管内注射到用5mg / kg LPS攻击的受体小鼠中。过继转移后 1 小时，灌洗肺以收集细胞以评估巨噬细胞对 CFSE 中性粒细胞的吞噬。
b 通过流式细胞术评估吞噬至少一个凋亡中性粒细胞的巨噬细胞的百分比，如图所示。4. 流式细胞术图像至少代表了三个独立实验。所有数据均表示为平均值±SD，n = 6 只小鼠，**P < 0.01 通过双侧学生 t 检验 （P = 0.0021）。
c 通过流式细胞术评估被巨噬细胞吞噬的过继转移的中性粒细胞的百分比，如图所示。4. 流式细胞术图像至少代表了三个独立实验。所有数据均表示为平均值± SD，n = 4 只小鼠，**P < 0.01 通过双侧学生 t 检验 （P = 0.0077）。
d 评估LPS诱导的急性肺损伤中体内老化中性粒细胞胞吐作用的实验方案。用CFSE染色来自WT和Gsdme KO小鼠的新鲜中性粒细胞。将CFSE标记的新鲜中性粒细胞气管内注射到用LPS攻击的受体小鼠中。过继转移后 6 小时，灌洗肺以收集细胞以评估巨噬细胞对 CFSE 中性粒细胞的吞噬。
e 通过流式细胞术评估吞噬至少一个凋亡中性粒细胞的巨噬细胞的百分比。流式细胞术图片代表了至少三个独立的实验。所有数据均表示为SD±均值，n = 5只小鼠;**P < 0.01 通过双侧学生 t 检验 （P = 0.0035）。
f 通过流式细胞术评估被巨噬细胞吞噬的过继转移中性粒细胞的百分比。流式细胞术图片代表了至少三个独立的实验。
见图八
在金黄色葡萄球菌诱导的肺炎期间，中性粒细胞中的GSDME破坏减轻了炎症。
图八
a 估金黄色葡萄球菌诱导的 WT 和中性粒细胞特异性 Gsdme 条件 KO 小鼠肺炎症和相关肺损伤的实验方案。中性粒细胞特异性 Gsdme 条件性 KO （Mrp8-cre（+）/Gsdme 诱导肺炎Δ/Δ）和他们的WT（Mrp8-cre（-）/GsdmeFL/FL） 使用金黄色葡萄球菌的同窝仔猪。在感染后的不同时间点评估中性粒细胞募集、肺部炎症和肺损伤。
b 来自Mrp8-cre（-）/Gsdme的BALF中总白细胞和中性粒细胞的定量FL/FL和 Mrp8-cre（+）/GsdmeΔ/Δ小鼠在指定时间点诱导肺炎后。数据表示为SEM的平均值±（n = 4-6只小鼠/组）。*P < 0.05，**P < 0.01 通过双侧学生 t 检验（WBC：24 小时，P = 0.0115;48 小时，P = 0.0125。中性粒细胞：24 h，P = 0.0107;48 h，P = 0.0058）。
c 感染金黄色葡萄球菌的小鼠 BALF 中的 IL-1β、IL-1 和 IL-10 水平。数据显示为SEM±平均值（n = 4-6只小鼠/组）。*P < 0.05。ND检测不到（IL-10，P =0.0221。IL-1β：24 h，P = 0.0118;48 小时，P = 0.0140。IL-6：24 h，P = 0.0081;48 小时，P = 0.0435）。
d 感染后 BALF 的 LDH 释放。数据表示为平均± SEM（n = 4-6 只小鼠/组）。*P < 0.05 通过双侧学生 t 检验（24 小时，P = 0.0049;48 小时，P = 0.0215）。
e BALF中的总蛋白质浓度。数据显示为平均± SEM （n = 4–6 只小鼠/组）。*P < 0.05 通过双侧学生 t 检验（24 小时，P = 0.009;48 小时，P = 0.0453）。
f Mrp8-cre（-）/Gsdme 肺部的细菌负荷FL/FL和 Mrp8-cre（+）/GsdmeΔ/Δ在指定的时间点感染金黄色葡萄球菌后的小鼠。数据表示为平均± SEM（n = 4-6 只小鼠/组）。**P < 0.01。NS 在双侧学生 t 检验中不显著 （P = 0.0035）。
g Mrp8-cre（-）/Gsdme 的 BALF 中的细菌计数FL/FL和 Mrp8-cre（+）/GsdmeΔ/Δ在指定的时间点感染金黄色葡萄球菌后的小鼠。数据以平均±SEM表示（n = 4-6/小鼠组）。P<0.001。NS 在双侧学生 t 检验中不显著 （P = 0.0007）。
02
研究结论
在这里，我们发现了GSDME在解决炎症方面的重要功能。通过决定中性粒细胞死亡的模式，GSDME可以作为治疗靶点来调节宿主防御和炎症。
因此，通过控制中性粒细胞死亡模式，GSDME决定了宿主的炎症结果，为感染性和炎症性疾病提供了潜在的治疗靶点。
好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理. 数据分析等支持.也随时可以联系我们。
