1.Folin-酚试剂法(Lowry法)
1.1原理
蛋白质在碱性溶液中肽键与Cu2+鳌合,形成蛋白质-铜复合物,还原酚磷钼酸,产生蓝色化合物,蓝色深浅与蛋白质浓度呈线性关系。由于产生的混合物的蓝色强度部分取决于酪氨酸和色氨酸含量,而它们在各种蛋白质中含量不同,因此会随不同的蛋白质而出现显色深浅的变化。通常用于酪氨酸和色氨酸的定量测定和蛋白质的相对浓度测定。
2.考马斯亮蓝法(Bradford法)
2.1原理
考马斯亮蓝测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝在游离状态下呈红色,最大光吸收在488 nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质—色素结合物在595 nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝结合在2 min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1 h内保持稳定。该法试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry法还高4倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0~1000 μg/mL,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
3.BCA法
3.1原理
BCA法基于双缩脲原理,碱性条件下蛋白质将Cu2+还原成Cu+,BCA鳌合Cu+作为显色剂,产生蓝紫色并在562 nm有吸收峰,单价Cu+与蛋白质呈剂量相关性。
4.凯氏定氮法
4.1原理
食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解,产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定,根据酸的消耗量计算氮含量,再乘以换算系数,即为蛋白质的含量。
5.分光光度法
5.1原理
食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解,分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵,在pH4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400 nm下测定吸光度值,与标准系列比较定量,结果乘以换算系数,即为蛋白质含量。
6.杜马斯法
6.1原理
试样在900°C~1200°C高温下燃烧,燃烧过程中产生混合气体,其中的碳、硫等干扰气体和盐类被吸收管吸收,氮氧化物被全部还原成氮气,形成的氮气气流通过热导检测器(TCD)进行检测。
7.茚三酮法
7.1原理
蛋白质水解后产生的氨基酸可发生茚三酮反应。除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应生成黄色物质外,所有的α氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。α氨基酸与茚三酮在弱酸性溶液中共热,反应后经失水脱羧生成氨基茚三酮,再与水合茚三酮反应生成紫红色,最终为蓝色物质。脯氨酸等仲胺氨基酸与茚三酮反应生成黄色物质。该反应可广泛用于各种氨基酸的定性或定量测定。
8. 双缩脲法
8.1原理
蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热,呈现紫色或红色,此反应称为双缩脲反应,双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。该反应是肽键常用的反应,即在碱性铜溶液中,肽键与铜离子形成络合物,呈紫色(在540nm有最大光吸收峰)。
1.1原理
蛋白质在碱性溶液中肽键与Cu2+鳌合,形成蛋白质-铜复合物,还原酚磷钼酸,产生蓝色化合物,蓝色深浅与蛋白质浓度呈线性关系。由于产生的混合物的蓝色强度部分取决于酪氨酸和色氨酸含量,而它们在各种蛋白质中含量不同,因此会随不同的蛋白质而出现显色深浅的变化。通常用于酪氨酸和色氨酸的定量测定和蛋白质的相对浓度测定。
2.考马斯亮蓝法(Bradford法)
2.1原理
考马斯亮蓝测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝在游离状态下呈红色,最大光吸收在488 nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质—色素结合物在595 nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝结合在2 min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1 h内保持稳定。该法试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry法还高4倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0~1000 μg/mL,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
3.BCA法
3.1原理
BCA法基于双缩脲原理,碱性条件下蛋白质将Cu2+还原成Cu+,BCA鳌合Cu+作为显色剂,产生蓝紫色并在562 nm有吸收峰,单价Cu+与蛋白质呈剂量相关性。
4.凯氏定氮法
4.1原理
食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解,产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定,根据酸的消耗量计算氮含量,再乘以换算系数,即为蛋白质的含量。
5.分光光度法
5.1原理
食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解,分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵,在pH4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400 nm下测定吸光度值,与标准系列比较定量,结果乘以换算系数,即为蛋白质含量。
6.杜马斯法
6.1原理
试样在900°C~1200°C高温下燃烧,燃烧过程中产生混合气体,其中的碳、硫等干扰气体和盐类被吸收管吸收,氮氧化物被全部还原成氮气,形成的氮气气流通过热导检测器(TCD)进行检测。
7.茚三酮法
7.1原理
蛋白质水解后产生的氨基酸可发生茚三酮反应。除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应生成黄色物质外,所有的α氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。α氨基酸与茚三酮在弱酸性溶液中共热,反应后经失水脱羧生成氨基茚三酮,再与水合茚三酮反应生成紫红色,最终为蓝色物质。脯氨酸等仲胺氨基酸与茚三酮反应生成黄色物质。该反应可广泛用于各种氨基酸的定性或定量测定。
8. 双缩脲法
8.1原理
蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热,呈现紫色或红色,此反应称为双缩脲反应,双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。该反应是肽键常用的反应,即在碱性铜溶液中,肽键与铜离子形成络合物,呈紫色(在540nm有最大光吸收峰)。