尼泊尔虎和豹身上的犬瘟热病毒（2023）
从塞伦盖蒂的非洲野狗（Lycaon pictus）到俄罗斯远东的老虎（Panthera tigris altaica），犬瘟热病毒（CDV）已多次被确定为对野生食肉动物的威胁。2020年至2022年间，六只花豹（P.pardus fusca）向尼泊尔当局报告患有致命的神经系统疾病，与犬瘟热病毒一致。在这里，我们报道了对尼泊尔野生猫科动物的血清调查结果。共检测了48份血清样本，包括28只孟加拉虎和20只花豹。在三只老虎和六只豹子身上发现了中和抗体，相当于血清流行率分别为11%（CI:2.8-29.3%，n=28）和30%（CI:12.8-54.3%，n=20）。超过三分之一的血清阳性动物出现症状，三只在采样后一周内死亡。对家养狗（Canis lupus famelis）的捕食被认为是一种潜在的感染途径。对现有饮食研究的比较表明，虽然尼泊尔的豹子经常捕食狗，但老虎不会，这可能支持这一假设。然而，还需要进一步的工作，包括分子分析来证实这一点。

犬瘟热病毒（CDV）已多次被确定为对野生食肉动物及其保护的威胁。据报道，最引人注目的疫情发生在群居性动物身上，如狮子（Panthera leo）、灰狼（Canis lupus）和非洲野狗（Lycoan pictus）。在这种情况下，疾病传播迅速，有时会导致当地种群的崩溃。然而，黑足鼬（Mustela nigripes）在野外的灭绝表明，独居食肉动物的风险也同样不少。任何小规模的孤立种群都容易受到随机效应的影响，与犬瘟热病毒相关的加性死亡率可能会产生重大影响。在俄罗斯，犬瘟热首次被确定为野生老虎的一种风险，在那里发现犬瘟热病毒CDV的存在可能会使小种群的东北虎（P.tigris altaica）50年内灭绝概率增加65%。自那以后，在印度尼西亚和印度的野生老虎和豹子身上检测到了这种病毒。野生猫科动物的特征性体征与进行性神经疾病有关，通常以癫痫发作和死亡告终。2020年至2022年间，至少有六只花豹（P.pardus fusca）向尼泊尔野生动物主管部门报告，并因出现与犬瘟热病毒病毒一致的症状而死亡。这项回顾性研究调查了尼泊尔野生虎豹中犬瘟热病毒CDV的血清流行率，这是了解其对这些种群潜在影响的第一步。

犬瘟热病毒CDV，也称为犬麻疹病毒，是犬科的一种高传染性单链RNA病毒。它在世界范围内分布，可以感染多种食肉动物以及其他哺乳动物目，包括啮齿动物和灵长类动物。传播通常通过直接接触或间接接触传染性物质发生，在某些物种中，幼崽群体的发病率和死亡率可达95%。那些康复的动物都经过了强有力的免疫。受威胁的分类群通常是继发感染的，以从更丰富的宿主中溢出。狗是地球上数量最多的食肉动物，未接种疫苗的种群通常被认为是感染源。然而，宿主可能很复杂。在某些情况下，狗可能只是更广泛的宿主群体中的一个贡献者，而在其他情况下，它们可能几乎没有或根本没有作用。
疾病通常在所有物种中遵循相同的模式，并大致由三个阶段组成。初始阶段发生在暴露后不久，其特征是短暂发热和淋巴细胞减少，因为病毒在淋巴组织中复制。随后是急性期，病毒感染上皮组织，导致各种临床症状，包括眼睛和鼻子的结痂分泌物、呼吸道和胃肠道症状，以及脚垫的病变。一些动物在这一点上死亡，而另一些动物则完全康复。第三组继续发展为神经系统疾病。这可能发生在急性期症状缓解后的某个时候发生，并且在性质上是渐进的。许多因素会影响感染的结果，但一旦动物进入神经系统阶段，死亡率几乎是不可避免的。

圈养猫科动物表现出一系列临床症状，但野生动物通常处于神经系统阶段。继2003年首次检测后，在俄罗斯远东地区又有四只野生老虎和一只远东豹被诊断出犬瘟热病毒CDV。在其他地方，印度尼西亚和印度的野生老虎和豹子已被证实感染了犬瘟热病毒。大多数病例表现为神经系统症状，包括定向障碍和缺乏恐惧。这种情况发展到癫痫发作和那些没有被安乐死的动物。在临床检查的病例中，体重减轻也是一个反复出现的特征，五只老虎中有四只和两只豹子在死亡时体重严重不足。
可以使用几种方法来研究犬瘟热，最合适的技术将取决于环境和可用的样本。在急性期，病毒在粪便和各种体液中传播，可以使用RT-PCR进行检测，测序可以深入了解遗传谱系和传播途径。脱落通常是短暂的，可能在动物出现神经系统症状时已经停止。也可以使用RT-PCR或免疫组织化学在死后样本中检测病毒，特别是大脑和淋巴组织。血清学检测可以识别过去的感染，在野生的种群中特别有用，在这些种群中，动物很少处理并且可能遗漏了主动感染。抗体通常在感染后10-20天可检测到，通常会持续一生。用于狗的商用台式试剂盒（ELISA或侧流免疫测定）依赖于物种特异性标记抗体，通常是狗抗体IgG或IgM[39，40]，尚未被验证可用于其他物种。血清中和试验（SNT）是目前唯一可靠的猫科动物血清学检测方法。

老虎在尼泊尔复兴，在过去12年中，老虎的数量估计几乎翻了两番。然而，在全球范围内，该物种仍然处于濒危状态，有3726至5578只动物被认为存在于野外（或2608至3905只成熟个体）。虎种群高度分散，仅限于占其以前范围不到7%的地区。尽管做出了重大努力，偷猎和栖息地丧失仍然是重大威胁，在尼泊尔，蓬勃发展的基础设施可能会逆转最近的成果。相比之下，人们对豹子的了解要少得多。该物种正在减少，被国际自然保护联盟列为易危物种，但在许多国家，其状况尚不清楚。目前对尼泊尔的评估始于2011年，并描述种群正在减少。最近的研究支持了这一点，该研究表明，偷猎、栖息地丧失，以及人类与野生动物的冲突正在造成持续的损失。在这两个物种中，与犬瘟热相关的附加死亡率可能会加剧其他威胁。然而，豹子也可能面临越来越大的暴露风险。老虎数量的恢复正在取代国家公园中的豹子，并增加了它们对公园内猎物的依赖。这种接触的增加可能为病原体传播创造新的机会。
这项研究使用存档的血清样本和基于假型的血清中和试验来测量尼泊尔野生虎豹中犬瘟热CDV抗体的血清流行率。血清学调查得到了临床病史和死亡率记录的支持。研究结果证实，这两个物种的个体都受到了感染，临床病史表明，其中一些感染导致了死亡。豹子的血清流行率高于老虎，这表明它们可能面临更高的暴露风险，但样本量小无法得出准确结论。

这项研究的重点是尼泊尔的两个地理区域，Terai和Mid丘陵。低地Terai沿该国南部边境延伸，是五个国家公园的所在地：舒克拉潘塔Shuklafanta国家公园（ShNP）、巴迪亚Bardia国家公园（BNP）、班克Banke国家公园（BaNP）、奇特旺Chitwan国家公园（CNP）和帕萨Parsa国家公园（PNP）。在它们之间，这些保护区总面积为3402平方公里（PS，真是够小），容纳了尼泊尔的大部分老虎。在国家公园内，景观是由长满青草的泛滥平原和热带森林组成的区域，但在这些地区之外，分布广泛丰富的耕地。Mid丘陵位于Terai以北，范围在600至4800米之间。在这里，大多数定居点都位于山谷中，而大部分山坡仍然森林茂密。该地区包括安纳普尔纳保护区Annapurna（ACA）的大部分地区。然而，与国家公园不同的是，人们生活或工作并没有被排除在这个地区之外。
总共有9个样本的犬瘟热CDV和抗体检测呈阳性。其中包括三只老虎（血清流行率10.7%CI:2.8-29.3%，n=28）和六只豹子（血清流行度30.0%CI:12.8-54.3%，n=20）。这两个物种的血清流行率在统计学上没有差异。

老虎Pt12是一只在奇特旺CNP外发现的年轻亚成年雄性，其身体受伤是与另一只雄性的战斗所致。据报道，在被捕期间，它的行为异常自信和好斗。经过临床检查，发现它很瘦。它被关起来接受护理，在那里它拒绝进食。被捕两天后，被发现死在围栏里。
老虎Pt23和Pt26表面上看起来都很健康。Pt23是一只成年雌性，在袭击一名森林警卫后被捕获。它在奇特旺CNP内部被释放。Pt26是一只身体状况良好的老年雄性，已经捕食牲畜一个月了。自从被俘以来，它一直在圈养中幸存下来。
豹Pp5在一个村庄被捕获，表现出呼吸困难、张开嘴呼吸和强直-阵挛发作的迹象。它被送往奇特旺CNP并接受护理，包括静脉输液治疗（IVFT）。工作人员报告说，它特别瘦，拒绝提供食物。癫痫发作并不断发展，变得更加频繁和严重，第二天它就去世了。
年轻成年雄性豹Pp7的滴度最高，它被当地人用网抓获。兽医工作人员注意到，它身体瘦弱、脱水，而且非常虚弱。头部有一些伤口，但这些伤口可能是在抓捕过程中造成的。豹子接受了抗生素、IVFT和护理。它起初不愿意吃东西，但后来完全康复，并在奇特旺放归。
豹Pp8、Pp11和Pp12表面上看起来都很健康，并被放归野外。Pp8是在一个鸡舍中发现的，Pp11和Pp12是在为应对该地区最近的捕食家畜事件而放置的箱式陷阱中捕获的。
豹Pp17被森林和土壤保护部门捕获，最初被怀疑是从高处坠落的。它消瘦，反应迟钝。无法站立，有后肢瘫痪和肌肉萎缩的迹象。左眼肿胀，左瞳孔扩张。右眼大小正常，但眼睛看起来浑浊。脚垫的皮肤变黑变厚（图2）。它食欲不佳，被捕后大约一周死亡。
对2019年9月至2022年9月的临床病史进行的审查发现，有6只豹子死于与犬瘟热CDV一致的症状（其中包括Pp17和其他5只未收集血清的豹子）。表S3中列出了这些动物，图1中给出了它们的位置。在所有情况下，动物都会出现致命的癫痫发作。在此期间，没有老虎患上致命神经系统疾病的记录。

在尼泊尔的43种食肉动物中，有21种濒临灭绝。这项研究首次证实了尼泊尔的野生食肉动物已经感染了犬瘟热CDV，这种病毒增加了小种群灭绝的可能性。尽管抗体的测量无法区分感染者和康复者，但六只血清阳性豹子中有三只的临床症状与犬瘟热CDV感染一致，包括体重减轻、呼吸困难和神经系统缺陷。豹Pp17还表现出特征性的脚垫增厚和眼部疾病，这两种疾病在感染犬瘟热CDV的狗中都得到了很好的识别，也是爪哇豹（P.pardus melas）最近病例的特征。两只患有神经系统疾病的豹子都死亡了。唯一恢复的豹子（Pp7）也具有最高的抗体滴度。高抗体滴度与存活率增加之间的关联在狗身上得到了充分的证明，恢复期滴度可以作为预后指标。因此，这些病例的情况高度提示临床犬瘟热感染，尽管如果没有RT-PCR等进一步检测，这一点无法得到证实。
被同类杀死的成年雄虎

2020年至2022年间，另有五只豹子死于急性发作，与犬瘟热病毒一致。不幸的是，这些动物的血清样本无法进行检测。这种表现的差异包括寄生虫病、肿瘤、中毒、头部创伤、狂犬病、脑膜炎、代谢性脑病、低血糖和癫痫。未来对病例进行尸检并收集组织进行RT-PCR分析，可以证实犬瘟热的存在，并可能产生序列数据，从而有可能深入了解宿主物种和传播途径的身份。此前，RT-PCR已用于检测多种样本中的犬瘟热CDV，包括生前鼻拭子、结膜拭子和直肠拭子以及尿液和尸检组织，如扁桃体、淋巴结、肺、肾、脾脏、大脑和毛皮。收集一组全面的样本最大限度地提高了检测病毒的机会，有助于排除差异和识别任何共同感染。

印度最近的一篇论文使用RT-PCR来识别各种猫科动物的感染，包括北方邦的老虎和豹子，北方邦南部与尼泊尔接壤。从北方邦的两个老虎样本中扩增和测序部分血凝素（H）基因，发现这些分离株与同一地区的一只狗分离株密切相关，具有99%的同一性。所有三个分离株均与3号遗传谱系聚在一起。从一只狮子、麝猫和另一只狗身上分离出来的病毒，同样都来自北方邦，聚集在一个单独的分支中，并与亚洲谱系有关。同时，对基因的扩增和部分测序显示，北方邦和邻近的中央邦（MP）的豹子（N=3）和狮子（N=3）的分离株分离出来。有趣的是，来自北方邦的一种麝猫分离株并没有与它们聚集在一起，而是与来自德国的菌株关系更密切。所有这些都表明，在尼泊尔附近的野生动物中存在多种毒株，甚至可能存在涉及不同物种的多个周期。可以将来自尼泊尔的未来分离物与这些数据进行比较，并用于调查跨界传播。
犬瘟热在环境中容易降解；因此，传播主要通过直接接触发生。在群居动物中，这可能通过梳理毛发、打架和共享食物来实现。独居食肉动物与同种动物的直接接触水平较低，因此减少了物种内传播的机会。在这种情况下，来自其他物种的传播变得越来越重要。捕食被认为是一种潜在的物种间传播模式，因为它为病毒转移提供了必要的密切接触。受感染的动物也可能变得虚弱，更容易被捕食。因此，饮食比较可以解释老虎和豹子血清流行率的差异。2012年至2022年间发表的一项对尼泊尔基于粪便的饮食研究的综述确定了13篇关于老虎或豹子的论文，其中11篇提供了足够的细节进行比较（表S4）。这说明了猎物选择的明显差异，所有研究都报告狗（或犬科动物）是豹子饮食的一个组成部分，而在老虎的粪便中没有发现狗的遗骸。众所周知，犬瘟热在尼泊尔的狗中传播，因此，较高水平的对狗捕食可能是豹子患病程度较高的原因。与尼泊尔日益增长的老虎种群，通过竞争使豹子离开了保护区，并增加了它们对保护区外猎物的依赖。如果豹子面临持续的压力，狗的消费量和相关的犬瘟热病毒暴露量可能会进一步增加。在附近的印度一些地区，人们发现狗在豹饮食中所占比例高达39%。
狗疫苗接种仅可作为一种策略，在受威胁的食肉动物在犬瘟热库中发挥不可或缺的作用，降低犬瘟热风险。在尼泊尔，老虎大多被限制在国家公园内，与狗的接触仅限于靠近公园边界和周围缓冲区的区域。作者看到了照片证据，证实尼泊尔的老虎偶尔会吃狗，但这种情况发生的频率远低于豹子（表S1）。在奇特旺CNP（<250米）和巴迪亚BNP（1000米）边界附近捕获血清阳性老虎；因此，狗的传播是合理的。然而，在俄罗斯，没有证据表明野狗是老虎的主要感染源，相反，野生食肉动物被认为是最有可能的感染源。在其他地方，狗似乎只是更复杂的病毒群落的一个贡献者。在这种情况下，为野狗接种疫苗将无法预防老虎感染。尼泊尔是多种食肉动物的家园，其中40%以上已被确定为易感染犬瘟热病毒。需要进一步的血清学和分子调查来评估这些野生动物宿主在犬瘟热病毒维持和传播给尼泊尔受威胁的大型猫科动物方面的相对重要性。

在世界许多地方，由于缺乏配备必要测试的实验室，野生动物中犬瘟热病毒的监测受到阻碍。由于出口禁令或许可证申请程序（如《濒危野生动植物种国际贸易公约》）的阻碍，可能无法进入国际实验室，这对及时监测造成了障碍，并削弱了实地研究人员的积极性。虽然PCR设施广泛可用，但很少有虎范围的定期进行血清中和测试来检测犬瘟热CDV中和抗体。尽管大多数国家都有很多必要的设备，如果不是全部的话。为了促进可持续性和未来的监测，我们选择不出口样本，而是在尼泊尔建立了检测方法（补充材料中给出了这一过程的详细信息）。所需的最低设施是可靠的电源、细胞培养实验室、带荧光的倒置显微镜和−80°C的冰箱。用GFP代替荧光素酶消除了对昂贵光度计的需求。由于检测中使用的模型是基于复制缺陷型水疱性口腔炎病毒，因此生物安全等级为二级或更高的实验室就足够了。此外，除HEK293DogSLAM细胞系外的所有成分都可以从商业上获得，但这可以通过使用线性聚乙烯亚胺用pDisplay dogSLAM转染商业上可获得的HEK293细胞来产生。
建立能够支持协调研究和监测工作的国家检测设施是非常可取的，也是可以实现的，并可能导致采样和合作的增加。这在处理大型食肉动物和受威胁物种时是相关的，因为单个群体或组织采样的动物数量可能相对较低。小样本量可能会阻碍分析，因为高度提示性的结果往往无法达到统计显著性。在尼泊尔，拉姆普尔农业林业大学和索拉哈生物多样性保护中心的现有设施为这一点提供了合适的基础，尽管应鼓励索拉哈分子实验室的进一步发展以及与国家科学技术院等其他机构的合作。DNPWC、森林和土壤保护部、非政府组织和大学之间的合作已经很强，但通过当地社区、地区兽医工作人员和政府兽医部门的参与，这些努力可以进一步加强。与以往一样，样本收集仍然是一个关键的优先事项。应注意确保现场工作人员有足够的设备正确收集和储存样本。
虽然需要进一步的研究和监测，但现在可以采取切实可行的措施来尝试和减轻犬瘟热病毒的风险。狗可能与传播有关，但为种群接种疫苗将是一项重要的工作，可能不会有回报。相反，野生动物管理者应该专注于建立韧性。小规模和孤立的种群面临的风险最大，应该针对这些种群做出努力。2022年，舒克拉潘塔国家公园只有36只老虎（CI:31-49），是尼泊尔老虎数量最少的公园之一。几乎没有其它老虎迁徙过来的证据，如果种群遭受重大损失，它们可能很难恢复。改善与其它虎种群的联系，包括印度西部特莱（Terai Arc）景观中的种群，将有助于解决这一问题。
那些研究豹子的人面临着不同的挑战。物种之间有很好的联系；然而，它没有受到与老虎相同级别的保护或监测。因此，包括疾病在内的任何威胁的影响都很难量化，直到为时已晚。基线种群估计和对持续监测的承诺对于为该物种的未来保护提供信息至关重要。与现有的老虎调查一样，这些工作需要由地方政府牵头，并得到非政府保护组织的支持。

个人总结：
1.尼泊尔虎和豹种群中犬瘟热病毒流行率11%和30%；
2.犬瘟热在尼泊尔的狗中传播，较高水平的对狗捕食可能是豹子患病程度较高的原因；
3.在尼泊尔附近的野生动物中存在多种犬瘟热毒株，甚至可能存在涉及不同物种的多个周期；
4.在附近印度一些地区，人们发现狗在豹饮食中所占比例高达39%；
5.犬瘟热病毒的存在可能会使小种群的东北虎50年内灭绝概率增加65%；
6.一旦被感染猫科动物进入神经系统阶段，死亡率几乎是不可避免的；
7.在奇特旺CNP（<250米）和巴迪亚BNP（1000米）边界附近捕获血清阳性老虎；
8.花豹没有受到与老虎相同级别的保护或监测。因此，包括疾病在内的任何威胁的影响都很难量化，直到为时已晚；
9.独居食肉动物与同种动物的直接接触水平较低，因此减少了物种内传播的机会；
10.捕食被认为是一种潜在的物种间传播模式，受感染的动物也可能变得虚弱，更容易被捕食；
11.在开放环境中生存的野生动物抗病毒能力更强。

毫无疑问家畜把很多病毒通过一些途径传染了野生动物。