Protein A亲和填料对于含有FC标签的抗体可以进行亲和层析，方法简便，但是鼠类的抗体对于Protein A填料的结合能力相对于其他物种的抗体要弱一些。本文作者探索了鼠类抗体纯化的三种方法：Protein A/Protein G混合模式，在盐析条件下结合以及混合模式层析。
材料和方法
使用摇瓶生产表达鼠源和兔源的单克隆抗体的HEK和CHO细胞，鼠的抗体为IgG2a，兔的单抗为IgG。Protein A, Protein G和Capto MMC购自GE Healthcare，CHT羟基磷灰石色谱柱(1mL)购自Bio-Rad。所有层析柱的保留时间均为2min。
结果与讨论
1. Protein A/Protein G混合模式
将两种填料以等体积混合，使用PBS平衡。将含有鼠源抗体的培养液上样到混合填料中，结果在流穿液中发现了一部分鼠源抗体。通过使用低pH洗脱余下的抗体，发现抗体收率很低。随后作者在上样样品中加入1M 硫酸铵，又将混合填料使用含有1M硫酸铵的PBS缓冲液进行平衡。通过低pH洗脱结合在填料上的抗体，发现此时的纯度较高。因此作者得出1M 硫酸铵并未显著改变抗体与两种填料结合能力的结论。
2. Protein A层析
在加入0.85M 硫酸铵的条件下，鼠抗体与经过PBS平衡的Protein A填料结合。在使用0.85M硫酸铵淋洗后，使用pH 7.0的20mM磷酸盐进行淋洗，从而洗脱少量的抗体(~20%)。使用1 M精氨酸，20 mM柠檬酸盐，pH4.8以高纯度洗脱剩余的结合mAb，这个条件比用于人源抗体的1M精氨酸最高洗脱pH要高，这说明了鼠抗体与Protein A填料的结合能力较弱。
3. Capto MMC层析
由于添加硫酸铵过程较为复杂，硫酸铵稀释了样品浓度同时又有可能引起蛋白质沉淀，所以作者又尝试了Capto MMC作为捕获步骤。
3.1鼠单克隆抗体
作者首先使用PBS平衡1mL层析柱后，将25mL(约2mg)含有鼠抗体的HEK培养基上样至层析柱，使用PBS和10mM 磷酸盐，0-100% 1M 精氨酸进行线性洗脱。结果如图1所示，E1泳道表现出有杂蛋白被洗脱，大多数鼠单克隆抗体在E2,E3被洗脱。E4,E5以及最后的1M 精氨酸只有杂蛋白出现。
随后，作者尝试了不同的洗脱条件，PBS和20mM磷酸盐，0-100% 1M NaCl，pH 7.0线性洗脱，结果如图2所示，大多数鼠单抗在E3, E4, E5中被洗脱，但是1M精氨酸中依然存在鼠单抗和杂蛋白。此时的上样体积依旧是25mL(约2mg)。
作者又尝试了上样体积50mL，使用pH 7.0的20mM磷酸盐进行柱平衡，通过在pH 7.0的20mM 磷酸盐中加入氯化钠进行逐步洗脱。结果如图3所示，在载量是上两次实验的两倍的情况下，在FT中并未发现鼠单抗流穿。使用0.1,0.2,0.3M NaCl淋洗时并未发现有鼠单抗被洗脱。随后作者在20mM磷酸盐中加入0.3M NaCl和0.2M 精氨酸调节pH至7.0进行洗脱，结果表明有大量的抗体和杂蛋白被洗脱，但是并未将杂蛋白与单抗分离。
随后作者在pH7.0 20mM 磷酸盐0.3M NaCl的基础上加入0-100% 0.3M精氨酸进行线性洗脱，结果如图4所示，FT中包含大部分杂蛋白，E2,E3中有80%的鼠单抗被洗脱，1M精氨酸中也有许多杂蛋白。此实验的上样体积为40mL(约4mg鼠单克隆抗体)。
上述实验表明，大多数鼠单克隆抗体在pH 7.0时可以通过线性洗脱至0.3M NaCl和0.3M精氨酸组合而洗脱，随后用含有相同抗体的CHO培养液进行了同样的实验。将25mL(约1mg)样品上样到1mL Capto MMC层析柱上，使用与上一步相同的洗脱条件，结果如图5所示，FT中有许多杂蛋白，进行线性洗脱时，大部分鼠单克隆抗体在E2中被洗脱，在最后的1M精氨酸中也可以看到有杂蛋白被洗脱。
提高了载量(75mL)后又重复了该实验，结果如图6所示，杂蛋白在FT和E1中被洗脱，E2和E3可以洗脱约90%的鼠单克隆抗体，E4和1M精氨酸也洗脱了大部分杂蛋白。
作者又尝试将羟基磷灰石层析柱作为精纯步骤，粗纯的鼠单克隆抗体是使用Capto MMC纯化HEK CM得到的，约有5mg单抗，使用50mM Tris pH 7.5稀释5倍。同时使用50mM Tris pH 7.5平衡1mL 羟基磷灰石层析柱。将样品上样后，使用pH 7.5的50mM Tris和0.3M 磷酸盐进行线性洗脱结合的蛋白。结果如图7所示，在FT中观察到少量杂蛋白，大部分鼠单抗被洗脱到E2,E3和E4中，总回收率大于80%。
3.2兔单克隆抗体
兔单克隆抗体在HEK CM中表达，SDS-PAGE结果表明是由两条带组成的，如图8所示，对此现象作者给出的解释是由于肽键剪切，糖基化或二硫键造成的。将HEK CM直接上样到pH 7.0的20 mM磷酸盐的Capto MMC中，结果并未与填料结合。将1M硫酸铵加入到CM中时，至少一部分抗体与填料结合。将Capto MMC用20mM 柠檬酸钠pH 5.2进行平衡，将CM用0.1M 柠檬酸钠pH 3.8滴定至pH 6.0。在这种条件下，没有兔的单抗流穿。但是低pH的CM也会增加杂蛋白的结合。使用pH 7.0的20mM磷酸盐对层析柱进行淋洗，但未洗脱兔单抗。最后作者使用20mM 磷酸盐缓冲液与0-100% 0.3M NaCl进行线性洗脱。结果如图8所示，E1，E2中洗脱了大部分兔的单克隆抗体，最后0.5M NaCl和1M 精氨酸也会洗脱许多杂蛋白。
将E1-E3在pH 7.5的Tris中进行羟基磷灰石层析精纯。但是当稀释五倍时，会有一部分兔的单抗流穿层析柱，当稀释十倍时也会有相同的流穿蛋白的值。结果如图9所示。
结论
作者证明了Capto MMC可以用于捕获纯化鼠和兔的单抗。作者认为洗脱条件优化需要针对不同的抗体种类。在精纯步骤中，羟基磷灰石对鼠的单克隆抗体有效。
编者认为，作者的缓冲液体系应用不够全面，应该多使用几种缓冲液体系进行优化，同时对于检测方面SDS-PAGE结果说明不够全面，纯度收率等方面没有有力的数据支持。但是至少可以为我们纯化鼠源单抗提供思路。
原文来源：
Arakawa T, Kurosawa Y, Storms M, Maruyama T, Okumura CJ, Kita Y. Capto MMC mixed-mode chromatography of murine and rabbit antibodies. Protein expression and purification. 2016;127:105-10.
Alliance Protein Laboratories, Abwiz Bio
生物治疗在近30年里取得了飞速发展，是目前医药领域中最令人瞩目、最鼓舞人心的焦点，已经成为临床治疗中不可缺少的重要部分。在细胞治疗领域，自体免疫细胞治疗技术(CAR-T,TCR-T,CTL,TIL和DC)、干细胞技术及基因治疗技术取得重大突破；在非细胞治疗领域，以治疗性抗体、疫苗和重组蛋白药物为代表的生物治疗药物已广泛应用于各个疾病治疗领域。
材料和方法
使用摇瓶生产表达鼠源和兔源的单克隆抗体的HEK和CHO细胞，鼠的抗体为IgG2a，兔的单抗为IgG。Protein A, Protein G和Capto MMC购自GE Healthcare，CHT羟基磷灰石色谱柱(1mL)购自Bio-Rad。所有层析柱的保留时间均为2min。
结果与讨论
1. Protein A/Protein G混合模式
将两种填料以等体积混合，使用PBS平衡。将含有鼠源抗体的培养液上样到混合填料中，结果在流穿液中发现了一部分鼠源抗体。通过使用低pH洗脱余下的抗体，发现抗体收率很低。随后作者在上样样品中加入1M 硫酸铵，又将混合填料使用含有1M硫酸铵的PBS缓冲液进行平衡。通过低pH洗脱结合在填料上的抗体，发现此时的纯度较高。因此作者得出1M 硫酸铵并未显著改变抗体与两种填料结合能力的结论。
2. Protein A层析
在加入0.85M 硫酸铵的条件下，鼠抗体与经过PBS平衡的Protein A填料结合。在使用0.85M硫酸铵淋洗后，使用pH 7.0的20mM磷酸盐进行淋洗，从而洗脱少量的抗体(~20%)。使用1 M精氨酸，20 mM柠檬酸盐，pH4.8以高纯度洗脱剩余的结合mAb，这个条件比用于人源抗体的1M精氨酸最高洗脱pH要高，这说明了鼠抗体与Protein A填料的结合能力较弱。
3. Capto MMC层析
由于添加硫酸铵过程较为复杂，硫酸铵稀释了样品浓度同时又有可能引起蛋白质沉淀，所以作者又尝试了Capto MMC作为捕获步骤。
3.1鼠单克隆抗体
作者首先使用PBS平衡1mL层析柱后，将25mL(约2mg)含有鼠抗体的HEK培养基上样至层析柱，使用PBS和10mM 磷酸盐，0-100% 1M 精氨酸进行线性洗脱。结果如图1所示，E1泳道表现出有杂蛋白被洗脱，大多数鼠单克隆抗体在E2,E3被洗脱。E4,E5以及最后的1M 精氨酸只有杂蛋白出现。
随后，作者尝试了不同的洗脱条件，PBS和20mM磷酸盐，0-100% 1M NaCl，pH 7.0线性洗脱，结果如图2所示，大多数鼠单抗在E3, E4, E5中被洗脱，但是1M精氨酸中依然存在鼠单抗和杂蛋白。此时的上样体积依旧是25mL(约2mg)。
作者又尝试了上样体积50mL，使用pH 7.0的20mM磷酸盐进行柱平衡，通过在pH 7.0的20mM 磷酸盐中加入氯化钠进行逐步洗脱。结果如图3所示，在载量是上两次实验的两倍的情况下，在FT中并未发现鼠单抗流穿。使用0.1,0.2,0.3M NaCl淋洗时并未发现有鼠单抗被洗脱。随后作者在20mM磷酸盐中加入0.3M NaCl和0.2M 精氨酸调节pH至7.0进行洗脱，结果表明有大量的抗体和杂蛋白被洗脱，但是并未将杂蛋白与单抗分离。
随后作者在pH7.0 20mM 磷酸盐0.3M NaCl的基础上加入0-100% 0.3M精氨酸进行线性洗脱，结果如图4所示，FT中包含大部分杂蛋白，E2,E3中有80%的鼠单抗被洗脱，1M精氨酸中也有许多杂蛋白。此实验的上样体积为40mL(约4mg鼠单克隆抗体)。
上述实验表明，大多数鼠单克隆抗体在pH 7.0时可以通过线性洗脱至0.3M NaCl和0.3M精氨酸组合而洗脱，随后用含有相同抗体的CHO培养液进行了同样的实验。将25mL(约1mg)样品上样到1mL Capto MMC层析柱上，使用与上一步相同的洗脱条件，结果如图5所示，FT中有许多杂蛋白，进行线性洗脱时，大部分鼠单克隆抗体在E2中被洗脱，在最后的1M精氨酸中也可以看到有杂蛋白被洗脱。
提高了载量(75mL)后又重复了该实验，结果如图6所示，杂蛋白在FT和E1中被洗脱，E2和E3可以洗脱约90%的鼠单克隆抗体，E4和1M精氨酸也洗脱了大部分杂蛋白。
作者又尝试将羟基磷灰石层析柱作为精纯步骤，粗纯的鼠单克隆抗体是使用Capto MMC纯化HEK CM得到的，约有5mg单抗，使用50mM Tris pH 7.5稀释5倍。同时使用50mM Tris pH 7.5平衡1mL 羟基磷灰石层析柱。将样品上样后，使用pH 7.5的50mM Tris和0.3M 磷酸盐进行线性洗脱结合的蛋白。结果如图7所示，在FT中观察到少量杂蛋白，大部分鼠单抗被洗脱到E2,E3和E4中，总回收率大于80%。
3.2兔单克隆抗体
兔单克隆抗体在HEK CM中表达，SDS-PAGE结果表明是由两条带组成的，如图8所示，对此现象作者给出的解释是由于肽键剪切，糖基化或二硫键造成的。将HEK CM直接上样到pH 7.0的20 mM磷酸盐的Capto MMC中，结果并未与填料结合。将1M硫酸铵加入到CM中时，至少一部分抗体与填料结合。将Capto MMC用20mM 柠檬酸钠pH 5.2进行平衡，将CM用0.1M 柠檬酸钠pH 3.8滴定至pH 6.0。在这种条件下，没有兔的单抗流穿。但是低pH的CM也会增加杂蛋白的结合。使用pH 7.0的20mM磷酸盐对层析柱进行淋洗，但未洗脱兔单抗。最后作者使用20mM 磷酸盐缓冲液与0-100% 0.3M NaCl进行线性洗脱。结果如图8所示，E1，E2中洗脱了大部分兔的单克隆抗体，最后0.5M NaCl和1M 精氨酸也会洗脱许多杂蛋白。
将E1-E3在pH 7.5的Tris中进行羟基磷灰石层析精纯。但是当稀释五倍时，会有一部分兔的单抗流穿层析柱，当稀释十倍时也会有相同的流穿蛋白的值。结果如图9所示。
结论
作者证明了Capto MMC可以用于捕获纯化鼠和兔的单抗。作者认为洗脱条件优化需要针对不同的抗体种类。在精纯步骤中，羟基磷灰石对鼠的单克隆抗体有效。
编者认为，作者的缓冲液体系应用不够全面，应该多使用几种缓冲液体系进行优化，同时对于检测方面SDS-PAGE结果说明不够全面，纯度收率等方面没有有力的数据支持。但是至少可以为我们纯化鼠源单抗提供思路。
原文来源：
Arakawa T, Kurosawa Y, Storms M, Maruyama T, Okumura CJ, Kita Y. Capto MMC mixed-mode chromatography of murine and rabbit antibodies. Protein expression and purification. 2016;127:105-10.
Alliance Protein Laboratories, Abwiz Bio
生物治疗在近30年里取得了飞速发展，是目前医药领域中最令人瞩目、最鼓舞人心的焦点，已经成为临床治疗中不可缺少的重要部分。在细胞治疗领域，自体免疫细胞治疗技术(CAR-T,TCR-T,CTL,TIL和DC)、干细胞技术及基因治疗技术取得重大突破；在非细胞治疗领域，以治疗性抗体、疫苗和重组蛋白药物为代表的生物治疗药物已广泛应用于各个疾病治疗领域。
