MLPA的基本原理包括探针和靶序列DNA进行杂交，之后通过连接、PCR扩增，产物通过毛细管电泳分离及数据收集，分析软件对收集的数据进行分析最后得出结论。每个MLPA探针包括两个荧光标记的寡核苷酸片段，一个由化学合成，一个由M13噬菌体衍生法制备；每个探针都包括一段引物序列和一段特异性序列。在MLPA反应中，两个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交，之后使用连接酶连接两部分探针。连接反应高度特异，只有当两个探针与靶序列完全杂交，即靶序列与探针特异性序列完全互补，连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链；反之，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有一个碱基的差别，就会导致杂交不完全，使连接反应无法进行。连接反应完成后，用一对通用引物扩增连接好的探针，每个探针的扩增产物的长度都是唯一的，范围在130～480bp。最后，通过毛细管电泳分离扩增产物，Genemarker软件分析，得出结论。只有当连接反应完成，才能进行随后的PCR扩增并收集到相应探针的扩增峰，如果检测的靶序列发生点突变或缺失、扩增突变，那么相应探针的扩增峰便会缺失、降低或增加，因此，根据扩增峰的改变就可判断靶序列是否有拷贝数的异常或点突变存在。
多重连接依赖性探针扩增（MLPA）是MRC-Holland的注册商标，是一种相对简单且成熟的多重PCR方法，用于检测多个靶标中的染色体DNA拷贝数变化。
顾名思义，探针的扩增取决于连接步骤，只有在样品中存在目标DNA时才会发生。这可以如下实现。对于短序列的目标DNA，设计了两个相邻的探针，分别包含正向和反向引物序列。另外，两个探针都包含一个填充序列，其长度可以根据实验的功能而变化。将探针与目标DNA杂交，然后连接。仅在发生连接时，功能性PCR链才会出现，因此扩增仅在样品中存在目标DNA时发生。PCR产物的量与样品中存在的目标DNA的量成正比，这使得该技术适用于定量测量（相对倍性）。汇集多个探针对，并用相同的引物对扩增，因此该技术不受多重PCR的常见限制影响。
正向引物经过荧光标记，因此可以使用毛细管电泳观察扩增子。
填充序列的长度不同，因此一次实验最多可以扩增和分离50个靶标。