三、高效液相系统组成
1、HPLC系统组成
HPLC 系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代 HPLC 仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。
目前常见的 HPLC 仪生产厂家国外有 Waters（沃特世） 公司、Agilent（安捷伦）公司 、岛津公司等，国内有大连依利特公司等。
1.1输液泵
输液泵是 HPLC 系统中最重要的部件之一。泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。输液泵应具备如下性能：①流量稳定，其RSD 应＜0.5%，这对定性定量的准确性至关重要；②流量范围宽，分析型应在0.1~10 ml/min 范围内连续可调，制备型应能达到 100ml/min；③输出压力高，一般应能达150~300kg/cm2；④液缸容积小；⑤密封性能好，耐腐蚀。
泵的种类很多，目前应用最多的是柱塞往复泵。
柱塞往复泵的液缸容积小，可至 0.1ml，因此易于清洗和更换流动相，特别适合于再循环和梯度洗脱；改变电机转速能方便地调节流量，流量不受柱阻影响；泵压可达400kg/cm2。其主要缺点是输出的脉冲性较大，现多采用双泵系统来克服。双泵按连接方式可分为并联式和串联式，一般说来并联泵的流量重现性较好（RSD 为 0.1%左右，串联泵为 0.2~0.3%） ，但出故障的机会较多（因多一单向阀），价格也较贵。
1.2进样器
1.2.1阀进样：一般 HPLC 分析常用六通进样阀（以美国 Rheodyne公司的 7725 和 7725i 型最常见），其关键部件由圆形密封垫（转子）和固定底座（定子）组成。由于阀接头和连接管死体积的存在，柱效率低于隔膜进样（约下降 5~10%左右） ，但耐高压（35~40MPa） ，进样:量准确，重复性好（0.5%） ，操作方便。
六通阀的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。①用部分装液法进样时，进样量应不大于定量环体积的 50%（最多 75％），并要求每次进样体积准确、相同。此法进样的准确度和重复性决定于注射器取样的熟练程度，而且易产生由进样引起的峰展宽。②用完全装液法进样时，进样量应不小于定量环体积的 5~10 倍（最少 3 倍） ，这样才能完全置换定量环内的流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性。 六通阀使用和维护注意事项：①样品溶液进样前必须用 0.45µm滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损。②转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置，否则流动相受阻，使泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力；再转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏。③为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀。通常可用水冲洗，或先用能溶解样品的溶剂冲洗，再用水冲洗。
1.2.2自动进样器：适用于大量样品的常规分析。
1.3色谱柱
色谱是一种分离分析手段， 分离是核心， 因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。市售的用于HPLC 的各种微粒填料如多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球（包括离子交换树脂）、多孔碳等，其粒度一般为 3,5,7,10μm等，柱效理论值可达5~16 万/米。对于一般的分析只需 5000 塔板数的柱效；对于同系物分析，只要 500 即可；对于较难分离物质对则可采用高
达 2 万的柱子，因此一般 10~750px左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。
1.3.1柱的构造
色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环） 、筛板（滤片） 、接头、螺丝等组成。柱管多用不锈钢制成，压力不高于 70kg/cm2 时，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。为提高柱效，减小管壁效应，不锈钢柱内壁多经过抛光。也有人在不锈钢柱内壁涂敷氟塑料以提高内壁的光洁度，其效果与抛光相同。还有使用熔融硅或玻璃衬里的，用于细管柱。色谱柱两端的柱接头内装有筛板，是烧结不锈钢或钛合金，孔径0.2~20µm(5~10µm)，取决于填料粒度，目的是防止填料漏出。
1.3.2色谱柱的性能评价
一般新的色谱柱在使用前都要对其性能进行考察，使用期间或放置一段时间后也要重新检查。柱性能指标包括在一定实验条件下（样品、流动相、流速、温度）下的柱压、理论塔板高度和塔板数、对称因子、容量因子和选择性因子的重复性，或分离度。一般说来容量因子和选择性因子的重复性在±5%或±10%以内。进行柱效比较时，还要注
意柱外效应是否有变化。
一份合格的色谱柱评价报告应给出柱的基本参数，如柱长、内径、填料的种类、粒度、色谱柱的柱效、不对称度和柱压降等。
1.4检测器
检测器是 HPLC 仪的三大关键部件之一。其作用是把洗脱液中组分的量转变为电信号。HPLC 的检测器要求灵敏度高、噪音低（即对温度、流量等外界变化不敏感）、线性范围宽、重复性好和适用范围广。
1.4.1分类
1）按原理可分为光学检测器（如紫外、荧光、示差折光、蒸发光散射）、热学检测器（如吸附热）、电化学检测器（如极谱、库仑、安培） 、电学检测器（电导、介电常数、压电石英频率）、放射性检测器（闪烁计数、电子捕获、氦离子化）以及氢火焰离子化检测器。
2）按测量性质可分为通用型和专属型（又称选择性）。通用型检测器测量的是一般物质均具有的性质，它对溶剂和溶质组分均有反应，如示差折光、蒸发光散射检测器。通用型的灵敏度一般比专属型的低。专属型检测器只能检测某些组分的某一性质，如紫外、荧光检测器，它们只对有紫外吸收或荧光发射的组分有响应。
1.4.2性能指标
1）噪音和漂移：在仪器稳定之后，记录基线 1 小时，基线带宽为噪音，基线在 1 小时内的变化为漂移。它们反映检测器电子元件的稳定性，及其受温度和电源变化的影响，如果有流动相从色谱柱流入检测器，那么它们还反映流速（泵的脉动）和溶剂（纯度、含有气泡、固定相流失）的影响。噪音和漂移都会影响测定的准确度，应尽量减小。
2）灵敏度：表示一定量的样品物质通过检测器时所给出的信号大小。对浓度型检测器，它表示单位浓度的样品所产生的电信号的大小， 单位为 mV·ml/g。 对质量型检测器，它表示在单位时间内通过检测器的单位质量的样品所产生的电信号的大小，单位为mV·s/g。
3）检测限：检测器灵敏度的高低，并不等于它检测最小样品量或最低样品浓度能力的高低，因为在定义灵敏度时，没有考虑噪声的大小，而检测限与噪声的大小是直接有关的。 检测限是检测器的一个主要性能指标，其数值越小，检测器性能越好。
4）线性范围：指检测器的响应信号与组分量成直线关系的范围，即在固定灵敏度下，最大与最小进样量（浓度型检测器为组分在流动相中的浓度）之比。也可用响应信号的最大与最小的范围表示，例如 Waters996 PDA检测器的线性范围是-0.1~2.0A。 定量分析的准确与否，关键在于检测器所产生的信号是否与被测样品的量始终呈一定的函数关系。输出信号与样品量最好呈线性关系，这样进行定量测定时既准确又方便。但实际上没有一台检测器能在任何范围内呈线性响应。通常A＝BCx，B 为响应因子，当 x=1 时，为线性响应。对大多数检测器来说，x 只在一定范围内才接近于 1，实际上通常只要x=0.98~1.02就认为它是呈线性的。 线性范围一般可通过实验确定。我们希望检测器的线性范围尽可能大些，能同时测定主成分和痕量成分。此外还要求池体积小，受温度和流速的影响小，能适合梯度洗脱检测等。
1.4.3紫外检测器(又称UV检测器是) HPLC 中应用最广泛的检测器，当检测波长范围包括可见光时，又称为紫外-可见检测器。它灵敏度高，噪音低，线性范围宽，对流速和温度均不敏感，可于制备色谱。由于灵敏高，因此既使是那些光吸收小、消光系数低的物质也可用UV检测器进行微量分析。但要注意流动相中各种溶剂的紫外吸收截止波长。如果溶剂中含有吸光杂质，则会提高背景噪音，降低灵敏度（实际是提高检测限）。此外，梯度洗脱时，还会产生漂移。
说明：上述就是高效液相系统的基本组成，本系列培训主要针对初学者，侧重于操作和实践，所以在理论介绍方面较为笼统。
1、HPLC系统组成
HPLC 系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代 HPLC 仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。
目前常见的 HPLC 仪生产厂家国外有 Waters（沃特世） 公司、Agilent（安捷伦）公司 、岛津公司等，国内有大连依利特公司等。
1.1输液泵
输液泵是 HPLC 系统中最重要的部件之一。泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。输液泵应具备如下性能：①流量稳定，其RSD 应＜0.5%，这对定性定量的准确性至关重要；②流量范围宽，分析型应在0.1~10 ml/min 范围内连续可调，制备型应能达到 100ml/min；③输出压力高，一般应能达150~300kg/cm2；④液缸容积小；⑤密封性能好，耐腐蚀。
泵的种类很多，目前应用最多的是柱塞往复泵。
柱塞往复泵的液缸容积小，可至 0.1ml，因此易于清洗和更换流动相，特别适合于再循环和梯度洗脱；改变电机转速能方便地调节流量，流量不受柱阻影响；泵压可达400kg/cm2。其主要缺点是输出的脉冲性较大，现多采用双泵系统来克服。双泵按连接方式可分为并联式和串联式，一般说来并联泵的流量重现性较好（RSD 为 0.1%左右，串联泵为 0.2~0.3%） ，但出故障的机会较多（因多一单向阀），价格也较贵。
1.2进样器
1.2.1阀进样：一般 HPLC 分析常用六通进样阀（以美国 Rheodyne公司的 7725 和 7725i 型最常见），其关键部件由圆形密封垫（转子）和固定底座（定子）组成。由于阀接头和连接管死体积的存在，柱效率低于隔膜进样（约下降 5~10%左右） ，但耐高压（35~40MPa） ，进样:量准确，重复性好（0.5%） ，操作方便。
六通阀的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。①用部分装液法进样时，进样量应不大于定量环体积的 50%（最多 75％），并要求每次进样体积准确、相同。此法进样的准确度和重复性决定于注射器取样的熟练程度，而且易产生由进样引起的峰展宽。②用完全装液法进样时，进样量应不小于定量环体积的 5~10 倍（最少 3 倍） ，这样才能完全置换定量环内的流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性。 六通阀使用和维护注意事项：①样品溶液进样前必须用 0.45µm滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损。②转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置，否则流动相受阻，使泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力；再转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏。③为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀。通常可用水冲洗，或先用能溶解样品的溶剂冲洗，再用水冲洗。
1.2.2自动进样器：适用于大量样品的常规分析。
1.3色谱柱
色谱是一种分离分析手段， 分离是核心， 因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。市售的用于HPLC 的各种微粒填料如多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球（包括离子交换树脂）、多孔碳等，其粒度一般为 3,5,7,10μm等，柱效理论值可达5~16 万/米。对于一般的分析只需 5000 塔板数的柱效；对于同系物分析，只要 500 即可；对于较难分离物质对则可采用高
达 2 万的柱子，因此一般 10~750px左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。
1.3.1柱的构造
色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环） 、筛板（滤片） 、接头、螺丝等组成。柱管多用不锈钢制成，压力不高于 70kg/cm2 时，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。为提高柱效，减小管壁效应，不锈钢柱内壁多经过抛光。也有人在不锈钢柱内壁涂敷氟塑料以提高内壁的光洁度，其效果与抛光相同。还有使用熔融硅或玻璃衬里的，用于细管柱。色谱柱两端的柱接头内装有筛板，是烧结不锈钢或钛合金，孔径0.2~20µm(5~10µm)，取决于填料粒度，目的是防止填料漏出。
1.3.2色谱柱的性能评价
一般新的色谱柱在使用前都要对其性能进行考察，使用期间或放置一段时间后也要重新检查。柱性能指标包括在一定实验条件下（样品、流动相、流速、温度）下的柱压、理论塔板高度和塔板数、对称因子、容量因子和选择性因子的重复性，或分离度。一般说来容量因子和选择性因子的重复性在±5%或±10%以内。进行柱效比较时，还要注
意柱外效应是否有变化。
一份合格的色谱柱评价报告应给出柱的基本参数，如柱长、内径、填料的种类、粒度、色谱柱的柱效、不对称度和柱压降等。
1.4检测器
检测器是 HPLC 仪的三大关键部件之一。其作用是把洗脱液中组分的量转变为电信号。HPLC 的检测器要求灵敏度高、噪音低（即对温度、流量等外界变化不敏感）、线性范围宽、重复性好和适用范围广。
1.4.1分类
1）按原理可分为光学检测器（如紫外、荧光、示差折光、蒸发光散射）、热学检测器（如吸附热）、电化学检测器（如极谱、库仑、安培） 、电学检测器（电导、介电常数、压电石英频率）、放射性检测器（闪烁计数、电子捕获、氦离子化）以及氢火焰离子化检测器。
2）按测量性质可分为通用型和专属型（又称选择性）。通用型检测器测量的是一般物质均具有的性质，它对溶剂和溶质组分均有反应，如示差折光、蒸发光散射检测器。通用型的灵敏度一般比专属型的低。专属型检测器只能检测某些组分的某一性质，如紫外、荧光检测器，它们只对有紫外吸收或荧光发射的组分有响应。
1.4.2性能指标
1）噪音和漂移：在仪器稳定之后，记录基线 1 小时，基线带宽为噪音，基线在 1 小时内的变化为漂移。它们反映检测器电子元件的稳定性，及其受温度和电源变化的影响，如果有流动相从色谱柱流入检测器，那么它们还反映流速（泵的脉动）和溶剂（纯度、含有气泡、固定相流失）的影响。噪音和漂移都会影响测定的准确度，应尽量减小。
2）灵敏度：表示一定量的样品物质通过检测器时所给出的信号大小。对浓度型检测器，它表示单位浓度的样品所产生的电信号的大小， 单位为 mV·ml/g。 对质量型检测器，它表示在单位时间内通过检测器的单位质量的样品所产生的电信号的大小，单位为mV·s/g。
3）检测限：检测器灵敏度的高低，并不等于它检测最小样品量或最低样品浓度能力的高低，因为在定义灵敏度时，没有考虑噪声的大小，而检测限与噪声的大小是直接有关的。 检测限是检测器的一个主要性能指标，其数值越小，检测器性能越好。
4）线性范围：指检测器的响应信号与组分量成直线关系的范围，即在固定灵敏度下，最大与最小进样量（浓度型检测器为组分在流动相中的浓度）之比。也可用响应信号的最大与最小的范围表示，例如 Waters996 PDA检测器的线性范围是-0.1~2.0A。 定量分析的准确与否，关键在于检测器所产生的信号是否与被测样品的量始终呈一定的函数关系。输出信号与样品量最好呈线性关系，这样进行定量测定时既准确又方便。但实际上没有一台检测器能在任何范围内呈线性响应。通常A＝BCx，B 为响应因子，当 x=1 时，为线性响应。对大多数检测器来说，x 只在一定范围内才接近于 1，实际上通常只要x=0.98~1.02就认为它是呈线性的。 线性范围一般可通过实验确定。我们希望检测器的线性范围尽可能大些，能同时测定主成分和痕量成分。此外还要求池体积小，受温度和流速的影响小，能适合梯度洗脱检测等。
1.4.3紫外检测器(又称UV检测器是) HPLC 中应用最广泛的检测器，当检测波长范围包括可见光时，又称为紫外-可见检测器。它灵敏度高，噪音低，线性范围宽，对流速和温度均不敏感，可于制备色谱。由于灵敏高，因此既使是那些光吸收小、消光系数低的物质也可用UV检测器进行微量分析。但要注意流动相中各种溶剂的紫外吸收截止波长。如果溶剂中含有吸光杂质，则会提高背景噪音，降低灵敏度（实际是提高检测限）。此外，梯度洗脱时，还会产生漂移。
说明：上述就是高效液相系统的基本组成，本系列培训主要针对初学者，侧重于操作和实践，所以在理论介绍方面较为笼统。
