产量的生理指标。本实验通过磺胺(或对氨基苯磺酸)比色法测定硝酸还原酶的活性，来了解植物生长发育期间氮素的营养水平，为合理施肥提供科学依据。
二、实验原理
硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中的关键性酶，与作物吸收和利用氮肥有
--关。它作用于N03使之还原为NO2：
N03-+NADH+H+→NO2-+NAD++H20
产生的NO2-可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定反应溶

液中NO2-含量的增加，即表现该酶活性的大小。这种方法简单易行，在一般条件
下都能做到。
NO2-含量的测定用磺胺比色法。在酸性条件下，对氨基苯磺酰胺与NO2-形成重氮盐，再与a一萘胺形成红色的偶氮染料化合物。反应液的酸度大则增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。增加温度可以增加反应速度，但降低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。这种方法非常灵敏，能测定每毫升含0.5µg的NaNO2 。

酸还原酶活性的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测
定。离体法复杂，但重复性较好。本次实验学习活体法对硝酸还原酶进行测定。
三、实验材料、设备和试剂
1．实验材料
小麦叶片
2．设备

(1)分光光度计 (2)真空泵(或注射器) (3)天平 (4)移液管 (5)试管
(6)离心管
3．试剂
(1)0．1 mol·L-1磷酸缓冲液，pH7.5。
贮备液A：称分析纯磷酸二氢钠(NaH2PO4)2.78 g，配成100mL，即成0.2 mol·L-1
NaH2P04溶液；
贮备液B：称Na2HPO4·12H2O 7.17 g，配成100 mL，即成0.2 mol·L-1 Na2HPO4溶液；
用时取贮备液A 16 mL，贮备液B 84 mL混合，用蒸馏水稀释至200 mL，即成为0.1 mol·L-1的磷酸缓冲液。

(2)0.2 mol·L-1 KNO3：溶解20.02 g KNO3于1000mL蒸馏水中。
(3)磺胺试剂：1g磺胺加25mL浓盐酸，用蒸馏水稀释至100mL。
(4)α-萘胺试剂：0.2 g α-萘胺，加25mL冰醋酸，用蒸馏水稀释至100mL。
(5)NaNO2标准溶液：取AR级的NaNO2 0.1000 g，用蒸馏水溶解并定容至100mL，
然后吸取5 mL，再用蒸馏水稀释至1000mL，即为每毫升含NaNO2为5 μg的标
准液。
四、操作步骤
1．材料的培养

和对照管中加入1mL 30%三氯乙酸，终止酶反应。
4．NO2-含量的测定
保温30min结束后，吸取反应液1mL于试管内，加磺胺试剂2mL，萘乙烯胺试剂2mL，混合摇匀，在25℃下，显色20min，生成红色化合物，颜色可稳定2～3 h，用721型分光光度计测波长为520nm的光密度。

式中：A一一硝酸还原酶的活性(µgNaNO2·g·h)； -1-1
C1一一从标准曲线查得测定瓶NaNO2平均值(µg)；
C2——从标准曲线查得对照瓶NaNO2平均值(µg)；
V——反应液总体积(5mL)；
W——样品重(g)；
T——反应时间(T)。

3．NO2-的提取
将取下的材料洗净、吸干，用刀片切成0.5 cm的小段(要求所选材料部位基本一致，切时尽量减少切口损伤)。分别称取①诱导的和②未诱导的材料各2份，每份0.525 g，分别放人离心筒内。在①内加磷酸缓冲液5mL+KNO3溶液5mL，另
一份内加磷酸缓冲液5mL+水5mL。在②内2份分别按①内2份加试剂，然后将离心筒放入离心机3000×g中离心10min，然后放置予真空干燥器中，接上真空泵抽气10min，放气后再抽气，反复3次，使测定材料沉于瓶底部为止，抽完气将真空干燥器置25℃黑暗中，保温30min。再分别向测定管

和对照管中加入1mL 30%三氯乙酸，终止酶反应。

赵志杰，史国安，董新纯编的《植物生理学实验指导》）
参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》
,P27
～
29