【应助达人团】生命科学论坛热门问答 最近在克隆一段基因有3000多bp，用的EcoR I和NdeI酶切位点。在酶切位点之上有3-5个保护碱基。将PCR产物以胶纯化的方式回收后加入EcoR I和 NdeI进行双酶切然后再胶回收的方式进行纯化然后再与以相同酶双酶切的pET28载体连接条件是16度过夜。将连接物10μl直接加入到100μl的感受态细胞中进行转化。复苏1h后离心全部涂布到加有抗生素的LB平板上37℃过夜培养。可是重复了几次之后还是在平板上生长不出任何的克隆来？请帮我看一下原因出在什么地方啊,谢谢了！
louie18的热心回答:
我个人是比较反感这种直接P了以后切连的方式的，看起来省时间，结果费工夫 1.看来是要做表达的，PCR的产物3000bp多少还是有错配的可能了，无论你用哪个公司标称的哪个高保真的酶，正统一点做还是应该连TA载体测序比较好。推荐连TAKARA simple系列T载体可以在后面比较稳定的产生你预期的酶切片段，如果觉得片段和载体酶切后大小相似可以在载体上找个酶切位点一起切把载体切断然后回收目的片段就可。 2.连到载体上以后可以相对比较好的保证有效酶切片段的回收量，更好的按照数量比例进行连接反应。 3.上述两者应该可以解决酶切片段的问题。一般出问题还是容易出在连接效率和转化效率上，可以先拿某个载体单酶切后自连，设置同等数量的载体不酶切作为对照，再把两者同时电泳，同时回收，取同等数量用连接酶作用，最后同时转化同批感受态，检测两个样品的生长情况可以知道是连接体系的问题还是感受态问题。 解决酶切，连接，转化三个效率后，剩下的就是重复实验~就OK了